Anticuerpos tri- o tetraespecíficos.

Anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno,

y

b) la cadena ligera modificada y la cadena pesada modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente, y/o en las que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y

c) en donde uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales se fusionan mediante un conector de péptidos con el extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas ligeras o cadenas pesadas de a) y/o de b).

Anticuerpos tri- o tetraespecíficos La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos tri-o tetraespecíficos, a su preparación y a su utilización.

Antecedentes de la invención Las proteínas manipuladas, tales como anticuerpos bi- o multiespecíficos capaces de unirse a dos o más antígenos, son conocidas de la técnica. Estas proteínas de unión multiespecíficas pueden generarse mediante fusión celular, conjugación química o técnicas de ADN recombinante.

Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo multiespecífico recombinante, por ejemplo anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997; documento WO nº 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007.

También se han desarrollado otros formatos nuevos en los que la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se conserva, tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de cadena sencilla (scFv, bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Hollinger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J., et. al., J. Immunol. Methods 318:65-74, 2007; Wu C., et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007) .

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores, para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína adicional de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007) . Aunque resulta evidente que los conectores presentan ventajas para la manipulación de los anticuerpos biespecíficos, también pueden provocar problemas en contextos terapéuticos. En efecto, estos péptidos foráneos pueden inducir una respuesta inmunológica contra el conector mismo o la unión entre la proteína y el conector. Además, la naturaleza flexible de estos péptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteolítico, conduciendo potencialmente a una pobre estabilidad del anticuerpo, a la agregación y a una mayor inmunogenicidad. Además, puede resultar deseable conservar funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , las cuales se encuentran mediadas por la parte Fc, mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a los anticuerpos naturales.

De esta manera, idealmente, el objetivo debe ser desarrollar anticuerpos biespecíficos que resulten muy similares en su estructura general a anticuerpos naturales (tales como IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) con una desviación mínima respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespecíficos que son muy similares a anticuerpos naturales utilizando la tecnología del cuadroma (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-540, 1983) , basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la línea celular de hibridoma (o cuadroma) híbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que únicamente una es el anticuerpo biespecífico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios mal apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos de purificación sofisticados (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007) . En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen técnicas de expresión recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como “botón en ojal”, pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen aminoácidos voluminosos por aminoácidos con cadenas laterales cortas, para crear un “ojal”. A la inversa, se introducen aminoácidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un “botón”. Mediante la coexpresión de estas dos cadenas pesadas (y de dos cadenas ligeras idénticas, que deben ser apropiadas para ambas cadenas pesadas) , se han observado rendimientos elevados de formación de heterodímeros (“botón-ojal”) frente a la formación de homodímeros (“ojal-ojal” o “botón-botón”) (Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y documento WO nº 96/027011) . El porcentaje de heterodímeros podría incrementarse adicionalmente mediante el remodelaje de las superficies de interacción de los dos dominios CH3 utilizando un enfoque de expresión fágica e introduciendo un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677681, 1998; Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 26-35, 1997) . Se describen nuevos enfoques para la tecnología de botonesen-ojales en, por ejemplo, el documento EP nº 1 870 459 A1. Aunque este formato aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresión hacia el uso clínico. Una importante limitación de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. De esta manera, esta técnica no resulta apropiada como base para el desarrollo sencillo de anticuerpos triespecíficos o tetraespecíficos recombinantes contra tres o cuatro antígenos de anticuerpo partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo antígenos, debido a que las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas deben optimizarse en primer lugar y después añadirse los péptidos de unión a antígeno adicionales contra el tercer y cuarto antígenos.

El documento WO nº 2006/093794 se refiere a composiciones heterodiméricas de unión a proteínas. El documento WO nº 99/37791 describe derivados de anticuerpo multiuso. Morrison S.L. et al., J. Immunolog. 160:2802-2808, 1998, se refieren a la influencia del intercambio del domino de región variable sobre las propiedades funcionales de la IgG.

Descripción resumida de la invención La invención se refiere a un anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y b) la cadena ligera modificada y la cadena pesada modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente, y/o en las que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y c) en donde uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales se fusionan mediante un conector de péptidos con el extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas ligeras o de las cadenas pesadas de a) y/o de b) .

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo triespecífico o tetraespecífico según la invención que comprende las etapas de:

a) transformar una célula huésped con

-vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de:

aa) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno, y ab) la cadena ligera modificada y la cadena pesada modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente, y/o en las que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y ac) en donde uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales se fusionan mediante un conector de péptidos con el extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas ligeras o de las cadenas pesadas de a) y/o de b) .

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y

c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende:

-vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de:

a)... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y b) la cadena ligera modificada y la cadena pesada modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente, y/o en las que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y c) en donde uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales se fusionan mediante un conector de péptidos con el extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas ligeras o cadenas pesadas de a) y/o de b) .

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende bajo c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende bajo c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a un tercer antígeno.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende bajo c) dos péptidos de unión a antígeno idénticos que se unen específicamente a un tercer antígeno.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende bajo c) un péptido de unión a antígeno que se une específicamente a un tercer antígeno y un péptido de unión a antígeno que se une específicamente a un cuarto antígeno.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los péptidos de unión a antígeno se seleccionan de entre el grupo de un fragmento scFv y un fragmento scFab.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFv.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFab.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los péptidos de unión a antígeno se fusionan con el extremo C-terminal de las cadenas pesadas de a) y/o de b) .

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de longitud completa de b) se reúnen, cada uno de ellos, en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en el que dicha interfaz se altera para inducir la formación del anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, en el que la alteración se caracteriza porque:

i) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que puede situarse en una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y ii) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro del cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina

(Y) y triptófano (W) , y dicho residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

12. Anticuerpo según la reivindicación 10 ó 11, caracterizado porque ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como el aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

13. Método para la preparación de un anticuerpo triespecífico o tetraespecífico según la reivindicación 1 ó 10, que comprende las etapas de:

a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de:

aa) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno, y ab) la cadena ligera modificada y la cadena pesada modificada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en las que los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente, y/o en las que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y ac) en donde uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno a dos antígenos adicionales se fusionan mediante un conector de péptidos al extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas ligeras o de las cadenas pesadas de a) y/o b) ,

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

14. Célula huésped que comprende los vectores según la reivindicación 13.

15. Composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 12.

16. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 12 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.