Uso de una nueva {al}-Proteobacteria para Quorum Quenching.

La presente invención se refiere a una cepa de una nueva especie de {al}-Proteobacteria afín al género Phaeobacter,

que es capaz de degradar las N-Acil-homoserin lactonas (AHLs), las cuales no pueden ser recuperadas significativamente por acidificación, indicando una actividad enzimática diferente a la lactonasa. Por tanto, el empleo de esta bacteria es útil para controlar las infecciones bacterianas, sin ejercer presión selectiva sobre las poblaciones de las bacterias patógenas y evitando así la aparición de resistencias. También permite la inhibición de otros procesos de colonización bacteriana en los que están implicadas las señales de "quorum sensing" o QS tipo AHL, como la formación de biofilms.

Uso de una nueva α-Proteobacteria para Quorum Quenching.

La presente invención se encuentra dentro de la biología, la biología molecular, y la acuicultura, y específicamente se refiere a una nueva α-Proteobacteria capaz de degradar N-acil-homoserín lactonas (AHLs) para el control de enfermedades infecciosas bacterianas, y para evitar la formación de biofilms.

Estado de la técnica anterior Numerosas especies bacterianas usan un mecanismo de regulación genética coordinada para responder a cambios en el entorno. Este mecanismo conocido como "quorum sensing" (QS) consiste en la producción y liberación de moléculas señal al medio donde se acumulan controlando la expresión de múltiples genes (Fuqua et al., 1994. J Bacteriol 176: 269-275) . Mediante la comunicación por QS las poblaciones bacterianas pueden coordinarse para ejecutar importantes funciones biológicas, muchas de ellas implicadas en la virulencia de importantes patógenos, como: movilidad, "swarming", agregación, luminiscencia, biosíntesis de antibióticos, factores de virulencia, simbiosis, formación y diferenciación de biofilms, transferencia de plásmidos por conjugación, ... (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1119-1134) .

Las señales de QS más estudiadas y conocidas son las N-acil-homoserin lactonas (AHLs) empleadas por numerosas bacterias Gram-negativas (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1119-1134) . Las AHLs, también conocidas como autoinducers (Als) , son una familia de moléculas señales usadas en el sistema de QS de muchas bacterias, principalmente Gram negativas, que se basan en un anillo lactona con una cadena lateral acilo de tamaño variable entre 4 y 14 carbonos, con o sin saturación y con o sin sustituciones Oxo-o Hidroxi-en el tercer carbono (Whitehead et al., 2001. FEMS Microbiol Rev 25: 365-404) . Como las poblaciones de especies bacterianas coordinadas por QS obtienen importantes ventajas competitivas en sus múltiples interacciones con otros procariotas y eucariotas, sus competidores han desarrollado mecanismos para interferir con su comunicación por sistemas QS, a estos mecanismos se les conoce como "quorum quenching" (QQ) . Existen dos tipos principales de mecanismos de QQ: un primer tipo se basa en la producción de moléculas inhibidoras/antogonistas que mimetizan las AHLs bloqueando o desestabilizando el receptor, como las furanonas producidas por el alga marina Delisea pulchra (Givskov et al., 1996. J Bacteriol 178: 6618-6622) . Otra estrategia para bloquear los sistemas de QS mediados por AHLs es la degradación enzimática de las moléculas señal. Hasta el momento, se han descrito dos tipos principales de enzimas que llevan a cabo esta degradación: las lactonasas que hidrolizan el anillo lactona y las acilasas que rompen el enlace entre el anillo lactona y la cadena lateral (Dong et al., 2007, Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211) . La actividad acilasa ha sido descrita en Pseudomonas aeruginosa PAO1, Ralstonia sp., Streptomyces sp., Rhodococcus er y thropolis, Anabaena sp. PCC 7120, Shewanella sp. y Variovorax paradoxus (Leadbetter and Greenberg, 2000, J Bacteriol 182: 6921-6926; Lin et al., 2003, Mol Microbiol 47: 849-860; Park et al., 2005, Appl Environ Microbiol 71: 2632-2641; Uroz et al., 2005, Microbiol 151: 3313-3322; Huang et al., 2006, Appl Environ Microbiol 72: 1190-1197; Sio et al., 2006, Infect Immun 74: 1673-1682; Romero et al., 2008, FEMS Microbiol Lett 280: 73-80) , mientras que la actividad lactonasa ha sido identificada en distintas cepas de los géneros Bacillus, Arthrobacter sp. y Rhodococcus, pero también está presente en algunos Gram negativos como Klebsiella y Agrobacterium (Dong and Zhang, 2005. J Microbiol 43: 101-109; Dong et al., 2007, Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211) .

Aunque la síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han supuesto en el siglo pasado una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, el desarrollo de resistencia a antibióticos por parte de algunas bacterias patógenas es un grave problema mundial, que obliga a la industria farmacéutica a desarrollar nuevas generaciones de antibióticos más potentes, y que puede originar cepas multirresistentes en las que el tratamiento es más largo y con frecuencia ineficaz, llegando incluso a la muerte del paciente. La presión selectiva que se ejerce en el ambiente microbiano, el estado inmunitario del hospedero, los microambientes bacterianos y factores propios de las bacterias involucradas, tienen un papel importante en el desarrollo de la resistencia. Es por lo tanto un objetivo prioritario para la industria farmacéutica el desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de las infecciones bacterianas.

Puesto que muchas bacterias usan el sistema de señales de QS para sincronizar la expresión genética y coordinar su actividad biológica dentro de una población, controlando la virulencia y la formación de biofilms entre otras funciones biológicas, una vía para evitar el aumento de mecanismos de resistencia de las bacterias patógenas (que en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico, llegando incluso a la muerte del paciente) sería controlar estos sistemas de señales QS mediante QQ. La posibilidad de utilización de la inhibición del quorum sensing para el tratamiento de enfermedades bacterianas ha sido revisada con anterioridad (Stephenson et al., 2004. Curr Med Chem 11:765-773; Hentzer et al., 2003. BioDrugs 17:241-250; Hentzer et al., 2003. J Clin Invest 112:1300-1307; Lyon et al., 2003. Chem Biol 10:1007-1021) . Debido a que gran cantidad de patógenos humanos (p. e.: Pseudomonas putida, Serratia spp., ...) , de plantas (p. e.: Agrobacterium spp., Erwinia carotovora, ...) y patógenos marinos (p. e.: Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, ...) (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1119-1134; Bruhn et al., 2005. Dis Aquat Org 65: 43-52) emplean AHLs para el control de la producción de factores de virulencia, la interferencia con estos sistemas de comunicación constituye una interesante y prometedora vía para el control de enfermedades infecciosas bacterianas (Dong & Zhang. 2005. J Microbiol 43: 101 -109; Dong et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211) .

Una de las actividades bacterianas de mayor importancia clínica y ecológica en la que intervienen los procesos de "quorum sensing" es la formación de biofilms, que requiere la producción, por parte de los microorganismos, de estas moléculas señal difusibles (Nadell et al., 2008. PLoS Biol 6 (1) : e14.doi:10.1371/journal.pbio.0060014) .

Los biofilms son películas biológicas que se desarrollan y persisten en las superficies, y que suelen ser estables y difíciles de eliminar debido a la naturaleza protectora de la matriz de polisacárido en la que están embebidos los microorganismos. Pueden definirse como una población bacteriana encerrada dentro de una matriz de polisacárido que se adhiere a las superficies. Se encuentran generalmente en las superficies de los equipamientos industriales que procesan o transportan líquidos, o en las superficies adyacentes a tales equipamientos. A menudo se encuentran en la superficie de los implantes médicos o en los dispositivos insertados en el organismo. También se pueden formar en áreas del cuerpo que están expuestas al aire; en particular en heridas y en la pleura. Uno de los biofilms biológicos que presenta mayor complejidad y de mayor relevancia clínica es la placa dental.

Los medicamentos convencionales, como por ejemplo, los antibióticos, son poco eficaces en infecciones que cursan a través de la formación de biofilms, debido a las barreras de difusión o al estado metabólico de los microorganismos en el biofilm.

Por tanto, mecanismos de interferencia del QS, es decir el QQ, solos o en combinación con antibióticos, constituyen una estrategia interesante en la inhibición de la formación de biofilms así como en el tratamiento de enfermedades infecciosas por patógenos multirresistentes, como Pseudomonas aeruginosa, en la que está descrito el control de QS sobre mecanismos de virulencia (Venturi, 2006. FEMS Microbiol Rev 30: 274-291) y otros patógenos de humanos, animales y plantas. Pseudomonas aeruginosa es una de las bacterias más infectivas y problemáticas, al formar biofilms difícilmente tratables con antibióticos convencionales. En pacientes con fibrosis quística coloniza los pulmones causando infecciones que son difíciles de tratar y a menudo, finalmente fatales. También es especialmente interesante para pacientes con heridas crónicas o con quemaduras.

Por tanto, este mecanismo puede ser interesante para el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Cepa de células bacterianas de α-Proteobacteria depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito CECT 7733.

2. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para provocar quorum quenching.

3. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para la elaboración de un medicamento.

4. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas.

5. Uso de la cepa según la reivindicación 4 donde la enfermedad infecciosa bacteriana la padece un animal acuático.

6. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para inhibir la formación de biofilms.

7. Uso de la cepa, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera de las reivindicaciones2a6, en combinación con antibióticos u otros agentes antibacterianos.

8. Uso de la cepa, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde la formación de biofilms y las enfermedades infecciosas bacterianas son provocadas por bacterias productoras de AHLs.

9. Composición que comprende un elemento seleccionado de la lista que comprende:

a. la cepa según la reivindicación 1,

b. el extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la cepa según la reivindicación 1,

c. el sobrenadante del cultivo bacteriano de (b) ,

o cualquiera de sus combinaciones.

10. Uso de la composición según la reivindicación 9 como agente antipatogénico.

11. Uso de la composición según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento.

12. Uso de la composición según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas.

13. Uso de la composición según la reivindicación 12 donde la enfermedad infecciosa bacteriana la padece un animal acuático.

14. Uso de la composición según la reivindicación 9 para inhibir la formación de biofilms.

15. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en combinación con antibióticos u otros agentes antibacterianos.

16. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 donde la formación de biofilms y las enfermedades infecciosas bacterianas son provocadas por bacterias productoras de AHLs.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Santiago de Compostela <120> "Uso de una nueva α-Proteobacteria para Quorum Quenching"

<130> 1596.32

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 970

<212> DNA

<213> Cepa bacteriana con número de depósito CECT 7733

<400> 1

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201030892

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 09.06.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

10. 109. Página 101; página 102, columna derecha. 1-16 A TOM DEFOIRDT et al. "Disruption of bacterial quorum sensing: an unexplored strategy to fight infections in aquaculture" AQUACULTURE, vol 240, 2004, página.

6. 88. Página.

7. 78 y 80. 1-16 A TORBEN MARTENS et al. "Reclassification of Roseobacter gallaeciensis Ruiz-Ponte et al. 1998 as Phaeobacter gallaeciensis gen. nov., comb. nov., description of Phaeobacter inhibens sp. nov., reclassification of Ruegeria algicola (Lafay et al. 1995) Uchino et al. 1999 as Marinovum algicola gen. nov. comb. nov., and emended descriptions of the genera Roseobacter, Ruegeria and Leisingera" INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, vol. 56, 2006, páginas 1293-1304. Resumen. 1-16 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 22.11.2011 Examinador S. González Peñalba Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201030892

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

A61K35/74 (2006.01) A61P31/04 (2006.01) C12N1/20 (2006.01) C12R1/01 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61K, C12N, C12R

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, NPL, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE, XPESP, EBI

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201030892

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 22.11.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201030892

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

10. 109. Página 101; página 102, columna derecha. D03 TOM DEFOIRDT et al. "Disruption of bacterial quorum sensing: an unexplored strategy to fight infections in aquaculture" AQUACULTURE, vol 240, 2004, página.

6. 88. Página.

7. 78 y 80. D04 TORBEN MARTENS et al "Reclassification of Roseobacter gallaeciensis Ruiz-Ponte et al. 1998 as Phaeobacter gallaeciensis gen. nov., comb. nov., description of Phaeobacter inhibens sp. nov., reclassification of Ruegeria algicola (Lafay et al. 1995) Uchino et al. 1999 as Marinovum algicola gen. nov. comb. nov., and emended descriptions of the genera Roseobacter, Ruegeria and Leisingera" INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, vol. 56, 2006, páginas 1293-1304. Resumen.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud de patente, tal y como ha sido redactada, hace referencia a una cepa de células bacterianas de alphaproteobacteria depositada en la colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito CECT 7733 (reivindicación 1) , al uso de dicha cepa para provocar quorum quenching (revindicación 2) , para la elaboración de un medicamento (reivindicación 3) , para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas bacterinas (reivindicación 4) , que padece un animal acuático (reivindicación 5) , para inhibir la formación de biofilms (reivindicación 6) , en combinación con otros agentes bacterianos (reivindicación 7) , donde la formación de biofilms y las enfermedades infecciosas bacterianas con provocadas por bacterias productoras de AHLs (reivindicación 8) . Se refiere también, a la composición que comprende la cepa o extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la cepa o el sobrenadante del cultivo bacteriano (reivindicación 9) y al uso de dicha composición (reivindicaciones 10-16) . NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA PCT ARTS. 6 Y 8 DE LA LP. El documento D01 hace referencia al hecho de que proteobacterias, tales como alfa-proteobacterias sean capaces de provocar quorum quenching. El estudio se lleva a cabo, entre otras, sobre Agrobacterium tumefaciens que es una alfa proteobacteria del género agrobacterium (véase páginas 1123-1124) . El documento D02 indica como un gran número de células bacterias utilizan el mecanismo conocido como quorum sensing para comunicarse entre ellas y como en este tipo de comunicación las señales químicas utilizadas más comúnmente son los compuestos AHL (N-acil-homoserin lactonas) (véase página 101) . Por otro lado, hace referencia también a la existencia de especies bacterianas que provocan quorum quenching mediante actividad enzimática. Entre dichas especies se puede destacar, entre otras, Agrobacterium tumefaciens que es una proteobacteria del tipo alfa-proteobacteria (véase página 102, columna derecha) . El documento D03 describe como moléculas que provocan quórum sensing pueden ser inactivadas enzimáticamente. Las enzimas que son capaces de inactivar las AHLs se han descubierto en especies tales como beta-proteobacterias, alfaproteobacterias , gamma-proteobacterias, entre otras (véase página.

7. 78) . Tales mecanismos de control se han encontrado en A. Tumefaciens, un tipo de alfa proteobacteria (véase página 80) . El documento D04 demuestra mediante análisis de secuencias de la región 16S de ARNr que la cepa T5 tiene una cercana afiliación son Roseobacter gallaeciensis, pero los resultados de caracterización fenotípica y genotípica demuestran que es una nueva especie. Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos, se propone la existencia de un nuevo género, Phaeobacter , y se considera que la cepa T5 es una nueva especie de este género (véase resumen) . En los documentos del estado de la técnica citados anteriormente, se ha encontrado el uso de proteobacterias, concretamente alfa-proteobacterias para degradar N-acil homoserin lactonas (AHLs) como mecanismo de actuación sobre los sistemas de quorum sensing, y de esta forma evitar la formación de biofilms y el crecimiento de bacterias que lo producen. Sin embargo, no se han encontrado células bacterias cuya región 16S del ARNr presenten una identidad de al menos 96% con la secuencia polinucleótioda recogida en la SEQ ID NO:1; y tampoco en dichos documentos citados existen sugerencias que dirijan al experto en la materia hacia la invención definida en las reivindicaciones 1-16, por lo que el objeto de las reivindicaciones 1-16 cumple los requisitos de novedad y actividad inventiva de acuerdo con los artículos 6 y 8 de la LP.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4