Uso de anticuerpos anti-CD100.

Anticuerpo neutralizante anti-CD100 que inhibe CD100 soluble (sCD100),

o un fragmento del mismo que se uneal antígeno, para su uso en la prevención o el tratamiento de trastornos mielínicos neuroinflamatorios seleccionadosde entre el grupo constituido por esclerosis múltiple, mielopatía asociada a HTLV-1, y polirradiculoneuritis.

Uso de anticuerpos anti-CD100.

La presente solicitud se refiere al uso de anticuerpos anti-CD100 para el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades neuroinflamatorias.

CD100 es un homodímero humano de 150 kDa expresado en la superficie de la mayoría de las células hematopoyéticas, y su gen pertenece a las familias de genes de Ig y semaforina (Bougeret et al, 1992; Herold et al, 1995) . Los genes de semaforina codifican proteínas solubles y unidas a la membrana, la mayoría de las cuales se ha demostrado que actúan como quimiorrepelentes sobre la guía del cono de crecimiento. Delaire et al., 1998, sugirieron que CD100 desempeña un papel en la activación de linfocitos T. Se demostró además que CD100 soluble inhibe la migración de células inmunitarias (Delaire et al., 2001) . Esta CD100 semaforínica inmunitaria humana (Hall et al., 1996; Bismuth et al., 2002) es liberada en grandes cantidades por linfocitos T con la activación a través de proteolisis mediante una metaloproteinasa (Elhabazi et al., 2001) . Se demostró además que se expresa en oligodendrocitos durante la mielinización (Moreau-Fauvarque, 2002) .

Se ha teorizado que CD100 podría desempeñar un papel crítico en interacciones inmunitarias neuronales en situación inflamatoria.

Las enfermedades neuroinflamatorias, incluyen esclerosis múltiple (MS) , la enfermedad desmielinizante inflamatoria principal del SCN, y la mielopatía asociada con infección por HTLV-1 (HAM/TSP) , se caracterizan por la destrucción de mielina y la pérdida de oligodendrocitos y axonal en el cerebro y en la médula espinal. La presencia de linfocitos T activados, junto con una mayor expresión de citocinas inflamatorias y metaloproteinasas, corresponde bien a lesiones activas en el sistema nervioso central (SNC) de los pacientes. Se sospecha que linfocitos T infiltrantes toman parte en la citotoxicidad, síntesis de moléculas inflamatorias, desregulación de la homeostasia oligodendrocítica y daños axonales.

Se investigó in vitro el efecto de células T crónicamente activadas que expresan sCD100, y sCD100 recombinante, sobre precursores neuronales pluripotentes humanos y sobre oligodendrocitos de ratas. Estos contactos celulares imitan interacciones que se producen durante la neuroinflamación entre linfocitos T y oligodendrocitos o precursores neuronales pluripotentes todavía capaces de generar neuronas u oligodendrocitos en el cerebro adulto (Zhang et al., 1999) .

Se ha analizado particularmente la supervivencia celular y las extensiones del proceso oligoendrocítico. Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales específicos anti-CD100, denominados BD16 y BB18, fueron capaces de bloquear la interacción de CD100 soluble con su receptor en células T activadas, con lo que evitaron la apoptosis de oligodendrocitos en la enfermedad asociada a HTLV-1.

Para apoyar la relevancia funcional de los resultados experimentales, también se exploró la presencia de sCD100 en el fluido cerebroespinal (CSF) y linfocitos T activados que expresan CD100 en cerebros post-mortem procedentes de pacientes con HAM/TSP.

Sobre esta base, ahora se propone usar los anticuerpos específicos anti-CD100, y especialmente los anticuerpos monoclonales denominados BD16 y BB18, en el tratamiento o diagnóstico de enfermedades neuroinflamatorias.

Los métodos de tratamiento o de diagnóstico de la solicitud son útiles para cualquier sujeto o paciente. “Tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya poseen el trastorno, así como los que tienen tendencia a sufrir el trastorno, o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. El paciente es preferentemente un ser humano, preferentemente un adulto, pero los métodos según la presente solicitud también se pueden aplicar a otros mamíferos o vertebrados.

Anticuerpos monoclonales anti-CD100

Los anticuerpos anti-CD100 preferidos usados según la presente invención son unos anticuerpos monoclonales denominados BD16 y BB18.

BD16 es un anticuerpo monoclonal de ratón que es producido por un hibridoma depositado en ECACC (número de depósito 92-01 0801) como se describe en la solicitud de patente internacional WO 93/14125. El asilamiento de este anticuerpo se describe en Herold et al, 1995. Este anticuerpo también se puede adquirir de Beckman-Coulter. Este anticuerpo se ensayó sobre la migración de células inmunitarias en Delaire et al., 2001.

BB18 es otro anticuerpo monoclonal de ratón que es producido por un hibridoma depositado en ECACC (número de depósito 92-01 0802) como se describe en la solicitud de patente internacional WO 93/14125. El asilamiento de este anticuerpo se describe en Bougeret et al., 1992.

Ambos anticuerpos, que son IgA, reconocen la forma humana de la semaforina CD100, vía epítopos conformacionales. Mientras que BB18 induce la internalización de CD100, BD16 promueve su liberación. Mientras que BB18 mantiene CD100 en asociación con cinasas, BD16 disocia estos complejos. BD16 es co-mitogénico con CD2 y CD3, mientras que BB18 es co-mitogénico con PMA (éster de forbol) . A pesar de estas características y propiedades diferentes, ambos anticuerpos BD16 y BB18 son útiles como anticuerpos de bloqueo.

Las formas híbridas y recombinantes de estos anticuerpos, así como sus fragmentos (por ejemplo, Fab, F (ab’) 2 y Fv) , también son útiles según la presente solicitud, en tanto que muestren la actividad biológica deseada.

Esto significa que los anticuerpos o sus fragmentos útiles según la invención son capaces de unirse a CD100 humana con esencialmente la misma afinidad y especificidad que el anticuerpo BD16 o BB18, y, cuando se usan con fines preventivos o de tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico, presentan esencialmente la misma propiedad de bloqueo con respecto a la actividad de CD100 humana que el anticuerpo BD16 o BB18.

Anticuerpos quiméricos o humanizados anti-CD100

Especialmente con respecto a la terapéutica en seres humanos, puede ser ventajoso usar formas quiméricas o humanizadas de los anticuerpos BD16 o BB18.

Los anticuerpos híbridos y recombinantes se pueden producir mediante corte y empalme de un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-CD100 con un dominio constante (por ejemplo anticuerpos “humanizados”) , o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o designación de la clase o subclase inmunoglobulínica, en tanto que presenten la actividad biológica deseada (véanse, por ejemplo, Cabilly et al., patente U.S. nº 4.816.567; Mage y Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987) ) .

Un aspecto de la presente solicitud engloba el uso de anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos.

Las formas “humanizadas” de los anticuerpos BD16 o BB18 son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas inmunoglobulínicas o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab’, F (ab’) 2, u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina de ratón. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región que determina la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de la especie no humana (anticuerpo donante) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos del armazón de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias importadas de CDR o del armazón. Estas modificaciones... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 que inhibe CD100 soluble (sCD100) , o un fragmento del mismo que se une

al antígeno, para su uso en la prevención o el tratamiento de trastornos mielínicos neuroinflamatorios seleccionados 5 de entre el grupo constituido por esclerosis múltiple, mielopatía asociada a HTLV-1, y polirradiculoneuritis.

2. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo BD16 y/o BB18 anti-CD100, o una forma quimérica, forma humanizada, o fragmento del mismo que se une al antígeno.

3. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo BD16 anti-CD100.

4. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo BB18 15 anti-CD100.

5. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es una forma quimérica de un anticuerpo BD16 anti-CD100.

6. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es una forma quimérica de un anticuerpo BB18 anti-CD100.

7. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es una forma

humanizada de un anticuerpo BD16 anti-CD100. 25

8. Anticuerpo neutralizante anti-CD100 según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es una forma humanizada de un anticuerpo BB18 anti-CD100.

9. Método in vitro para el diagnóstico o la determinación de la evolución de un trastorno mielínico inflamatorio del

sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP) , método que comprende evaluar una semaforina CD100 en una muestra biológica de un sujeto de ensayo, compararla con el nivel de una semaforina CD100 en una muestra biológica de un sujeto de control, en el que un nivel incrementado de CD100 es indicativo de dicho trastorno o de que la afección del sujeto de ensayo ha empeorado, en el que el ensayo es un inmunoensayo que emplea un anticuerpo BD16 y/o BB18 anti-CD100, o una forma quimérica, forma humanizada, o fragmento del

mismo que se une al antígeno, en el que la determinación de la evolución de un trastorno mielínico inflamatorio del SNC o del SNP comprende evaluar una semaforina CD100 en una muestra biológica de un sujeto de ensayo en un primer punto en el tiempo y comparar el nivel de una semaforina CD100 en una muestra biológica del mismo sujeto de ensayo en un segundo punto en el tiempo, en el que el trastorno mielínico inflamatorio se selecciona de entre el grupo constituido por esclerosis múltiple, mielopatía asociada a HTLV-1, y polirradiculoneuritis.

10. Método según la reivindicación 9, en el que se evalúa la semaforina CD100 por medio de una técnica de ELISA.

11. Método según la reivindicación 10, en el que se evalúa la semaforina CD100 en muestras de CSF.

45 12. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo BD16 anti-CD100.

13. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo BB18 anti-CD100.

14. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es una forma quimérica o una forma humanizada de 50 un anticuerpo BD16 anti-CD100.

15. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es una forma quimérica o una forma humanizada de un anticuerpo BB18 anti-CD100.