Un método para producir un anticuerpo monoclonal glicosilado o proteína de fusión Fc que tiene al menos un 70% de N-glicanos Man5-9(GlcNAc)2,

y un 10% o menos de N-glicanos complejos, por proporción molar, en relación a todos los N-glicanos, que comprende:

(a) proporcionar un anticuerpo monoclonal que produce una célula mamífera o una proteína de fusión Fc que produce una célula mamífera;

(b) cultivar la célula en presencia de kifunensina; y

(c) recuperar el anticuerpo glicosilado o proteína de fusión Fc.

Terapeuticos basados en anticuerpos con actividad ADCC mejorada

Campo técnico

El campo técnico de la invención de refiere de forma general a la glicobiólogia de proteínas y, más particularmente a la ingeniería o producción de anticuerpos así como a las implicaciones clínicas de la glicosilación en varias terapéuticos basados en anticuerpos como, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y las proteínas de fusión lg.

Antecedentes de la invención

Los terapéuticos basados en anticuerpos, es decir los anticuerpos monoclonales (mAbs) y las proteínas de Fusión Fc, han alcanzado ahora “la mayoría de edad” como terapéuticos. Hay por lo menos dieciocho mAbs y dos moléculas de fusión en el mercado y más de 150 están actualmente en pruebas clínicas (ver, por ejemplo, Holliger y otros (2005) Nature Biotech., 23: 1126-1136 y Theillaud (2005) Expert Opin. Biol. Ther., 5 ( Suppl. 1) : S15-S27) . Las indicaciones para estos terapéuticos son variadas e incluyen, por ejemplo, el transplante de órganos (OKT3®, Simulect®, Zenapax®) , la oncología (Rituxan®, Panorex®, Herceptin®, Mylotarg®, Campath®, Zevalin®, Bexxar®, Erbitux®, Avastin®, HuMax-CD4™) , las enfermedades infecciosas (Synagis®) , las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, (Humira®, Amevive®, Enbrel®) , y el asma alérgico (Xolair®) . La actividad terapéutica de dichos fármacos puede ser mediada por diferentes mecanismos de acción, por ejemplo, inhibiendo los eventos de señalización en las células objetivo, por inducción directa de la apoptosis, así como por mecanismos inmunológicos indirectos, como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) a través del enlace de los receptores Fc y la citotoxicidad dependiente de complemento a través del enlace al C1 q (ambos mecanismos son denominados colectivamente como “funciones efectoras”) .

Los mAbs de ratón fueron hechos primero por Köhler y otros en 1975 (Nature (1975) 256:495-497) . El primer mAb que fue aprobado para uso clínico es un anticuerpo murino (OKT3®) . Sin embargo, las funciones efectoras, la inmunogenicidad, y las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de ratones (la mayoría de ellos siendo IgG1 o IgG2a y, en algunos casos, IgG2b) no son por lo general satisfactorias para usos terapéuticos en humanos. Por ejemplo, cuando los anticuerpos de ratones se prueban con células de origen humano, el nivel de ADCC es sustancialmente más bajo que con las células de ratones. Estudios adicionales explican que las regiones Fc de los anticuerpos son responsables de las funciones efectoras, y que el ADCC reducido se debe a una menor afinidad de enlace de la región Fc de la IgG murino a los preceptores Fcy en comparación con los anticuerpos humanos.

Se ha realizado un gran esfuerzo para producir terapéuticos basados en anticuerpos con inmunogenicidad disminuida y funciones efectoras optimizadas en humanos. Como resultado, se han desarrollado anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión basadas en anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos. La mayoría de los anticuerpos quiméricos y humanizados, así como las moléculas de fusión basadas en anticuerpos, contienen una región Fc derivada del IgG1 humano, porque esta subclase muestra características (enlace FcyRs, suero, vida media) y propiedades funcionales (ADCC, fagocitosis, endocitosis, activación complementaria) deseables para ciertos tipos de intervención inmune.

A pesar de que algunos terapéuticos basados en anticuerpos pueden funcionar sin utilizar mecanismos efectores de anticuerpos, otros pueden necesitar reclutar al sistema inmunológico para matar las células objetivo. Si el reclutamiento dela sistema inmunológico es deseable par aun terapéutico particular, la ingeniería de la porción Fc de la IgG para mejorar la función efectora (por ejemplo enlace mejorado a los receptores de la IgG y/o el complemento) puede ser una mejora valiosa.

Se han explorado varias estrategias para mejorar el reclutamiento del sistema inmunológico, incluyendo; anticuerpos biespecíficos, en los que un brazo del anticuerpo enlaza con un receptor Fcy (ver, por ejemplo, Segal y otros (1999) Curr. Opin. Inmunol., 11: 558-562) ; moléculas de fusión IgG-citocinas (por ejemplo, IL-10-Fc, IL-15-Fc) , y la mutación de residuos de aminoácido responsables del enlace con el FcyRs (ver por ejemplo, Shields y otros (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604) .

La glicosilación de las inmunoglobulinas puede ser un determinante esencial para las funciones efectoras. Por lo tanto, otro enfoque para modificar la función efectora de una IgG particular es diseñar el patrón de glicosilación de la región Fc.

Una molécula de IgG contiene un oligosacárido N-vinculado enlazado covalentemente al Asn297 conservado de cada uno de los dominios CH2 en la región Fc. Los oligosacáridos encontrados en la región Fc del suero de las IgGs son mayoritariamente glicanos biantenarios del tipo complejo. Variaciones de los patrones de glicosilación de la IgG incluyen el enlace del ácido siálico terminal, un tercer brazo GIcNAc (GIcNAc bisector) , una galactosilación terminal, y una fucosilación del nucleo a-1, 6-enlazada. Los oligosacáridos pueden contener cero (G0) , una (G1) , o dos (G2) galactosas (ver Figura 1A) . EL patrón exacto de glicosilación depende de las propiedades estructurales de los subcomponentes de la IgG, en particular, de los dominios CH2 y CH3 (Lund y otros (2000) Eur.

J. Biochem., 267: 7246-7257) . Las líneas celulares usadas para producir nabs o moléculas de fusión de IgG recombinantes (más a menudo derivadas de líneas celulares de ratones y hámsteres) pueden también influir en la síntesis de las cadenas de oligosacáridos.

La fracción oligosacárida de las glicoproteínas es inicialmente sintetizada de los oligosacáridos lípidoenlazados para formar un Clc3Man9GlCNAc2-pirofosforilo-dolicol que es después transferido a la proteína en el retículo endoplásmico (ER) (ver Figura 1B) . La parte oligosacárida es después procesada en la secuencia siguiente. Primero, los tres residuos de glucosa (Glc) son eliminados por glucosidasas I y II para producir la proteína Man9ClcNAC2. La estructura Man9ClcNAC2 puede ser adicionalmente procesada por la eliminación de un número de residuos de manosa (Man) . Inicialmente, se eliminan cuatro manosas a1, 2-enlazadas para dar una Man5GlcNAc2proteína que es después alargada por la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) . Esta nueva estructura, la GlcNAcMan5GlcNAC2-proteína, es el sustrato para la manosidasa II que elimina las manosas a1, 3 y a1, 6-enlazadas. Después de esto, se añaden secuencialmente los otros azúcares, GlcNAc, la galactosa y el ácido siálico para dar los tipos complejos de estructuras que se encuentran a menudo en las glicoproteínas.

Varios estudios han investigado la relación entre las glicoformas de la IgG y las ADCC FCyRIIIdependientes.

Galactosa - La Eliminación de la mayoría de los residuos de galactosa de la IgG1 mAB humanizada (Campath®) resultó en una actividad de lisis del complemento reducida pero no tuvo efecto en la ADCC (Body y otros (1995) Mol. Inmunol., 32:1311-1318) . Sin embargo, una forma altamente galactosilada de una IgG monoclonal anti-RhD humana es más activa en análisis ADCC que la forma agalactosilada (Kumpel y otros (1994) Antibodies Hybridomas, 5:143-151) . Así el impacto de la galactosización del oligosacárido de la IgG en la ADCC es discutible.

Ícido Siálico – El ácido siálico terminal parece que no tiene efecto en la ADCC (Body y otros (1995) Mol. Immunol., 32:1311-1318) .

N-acetil-glucosamina – Varios estudios se han concentrado en el papel del GlcNAc bisector en el enlace al FcyRII y a ADCC. El patrón de glicosización de un anticuerpo antineuroblastoma de IgG1 quimérica ha sido diseñado en células de CHO transfectadas con º-1, 4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) (Umana y otros (1999) Nature Biotech., 17:176-180; ver también la Patente U.S Nº 6.602.684) . Este enzima cataliza la adición del residuo del GlcNAC bisector al oligosacárido N-enlazado. El GlcNAc bisector bloquea la fucosilación del núcleo a1, 6-enlazado de los N-glicanos, ya que la a1, 6-fucosiltransferasa no puede usar eficientemente los N-glicanos bisectores como sustratos (Longmore y otros (1982) Carbohydrate Res., 100:365-392) . La IgG producida en esta línea celular mostró una actividad ADCC aumentada. Sin embargo, la contribución... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un anticuerpo monoclonal glicosilado o proteína de fusión Fc que tiene al menos un 70% de N-glicanos Man5-9 (GlcNAc) 2, y un 10% o menos de N-glicanos complejos, por proporción molar, en relación a todos los N-glicanos, que comprende:

(a) proporcionar un anticuerpo monoclonal que produce una célula mamífera o una proteína de fusión Fc que produce una célula mamífera;

(b) cultivar la célula en presencia de kifunensina; y

(c) recuperar el anticuerpo glicosilado o proteína de fusión Fc.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la kifunensina se usa a una concentración de 0, 01 a 100 Ig/ml durante un periodo de al menos 12 horas.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la kifunensina se usa a una concentración de 0, 01 a 50 Ig/ml durante un periodo de al menos 12 horas.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la kifunensina se usa a una concentración de 0, 01 a 20 Ig/ml durante un periodo de al menos 12 horas.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la kifunensina se usa a una concentración de 0, 01 a 10 Ig/ml durante un periodo de al menos 12 horas.

6. El método de la reivindicación 1, en donde las células de ovario de hámster chino CHO o de hibridoma se incuban con 0, 5 a 10 Ig/ml de kifunensina durante 10 días.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal o proteína de fusión Fc tiene al menos un 90% de N-glicanos Man5-9 (GlcNAc) 2.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal o proteína de fusión Fc tiene menos de un 30% de N-glicanos Man5 (GlcNAc) 2 y/o Man6 (GlcNAc) 2 por proporción molar, en relación a todos los N-glicanos.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal o proteína de fusión Fc tiene menos de un 30% de N-glicanos fucosilados por proporción molar, en relación a todos los N-glicanos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las células son células de ovario de hámster chino CHO, células de hibridoma de ratón, células de mieloma, células de riñón embrionarias humanas, células de riñón de mono, células de carcinoma epitelial humanas, células de fibrosarcoma humanas, o células de riñón de hámster bebé.

11. El método de la reivindicación 10, en donde las células son células de CHO.