Separación de componentes conjutados y no conjugados.

Un procedimiento para analizar el grado de no conjugación de una muestra que comprende un componente desacárido conjugado y un componente no conjugado,

que comprende las etapas de (i) poner en contacto la muestracon un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugadode la muestra y obtener de este modo un sobrenadante que comprende el componente no conjugado separado y (ii)analizar el contenido del sobrenadante para dar el contenido no conjugado de la muestra, en el que el componentede sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipitaselectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicasson de pH 9 a 11.

Separación de componentes conjugados y no conjugados

Campo técnico

La presente invención se refiere al análisis y control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos (por ejemplo, sacáridos capsulares bacterianos) , y especialmente aquellas en las que los sacáridos están conjugados con un vehículo. En particular, la invención es útil para el análisis y control de calidad de vacunas conjugadas que comprenden un conjugado de un sacárido que contiene un resto de ácido siálico, por ejemplo, un sacárido capsular bacteriano de Streptococcus agalactiae (también conocido como estreptococo de grupo B (GBS) ) .

Antecedentes de la invención Son bien conocidos en la técnica inmunógenos que comprenden antígenos de sacáridos capsulares conjugados con proteínas vehículo. La conjugación convierte antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, potenciando de este modo las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle inmunidad protectora, y la vacuna conjugada prototipo fue para Haemophilus influenzae tipo B (Hib) [por ejemplo, véase el capítulo 14 de la referencia 1]. Como la vacuna Hib, se han desarrollado vacunas de sacárido conjugado para proteger contra Neisseria meningitidis (meningococo) y contra Streptococcus pneumoniae (neumococo) . Otros organismos donde las vacunas conjugadas son de interés son Streptococcus agalactiae (GBS) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4].

Las vacunas conjugadas para N. meningitidis del serogrupo C se han aprobado para uso humano, e incluyen MenjugateTM [5], MeningitecTM y NeisVac-CTM. Se ha informado de mezclas de conjugados para cada uno de los serogrupos A, C, W135 e Y [por ejemplo, referencias 6-9], incluyendo el producto MenactraTM. Otras mezclas de antígenos conjugados incluyen: (i) mezclas de meningococos A/C [10, 11]; (ii) el producto PrevNarTM [12] que contiene siete conjugados de neumococos; (iii) conjugados mixtos de meningococos y Hib [13, 14]; y (iv) conjugados de meningococos, neumococos y Hib combinados [15].

Los problemas cuando se trata con vacunas conjugadas incluyen la estabilidad y uniformidad lote a lote. En vacunas Hib, por ejemplo, se ha informado de la despolimerización catalítica del sacárido [16], y los conjugados de la cápsula de meningococos del serogrupo A se hidrolizan fácilmente [17]. La inestabilidad de los conjugados conduce indeseablemente a una reducción en la dosis eficaz del conjugado inmunogénico en el tiempo, variación entre lotes, y niveles aumentados de productos de descomposición no caracterizados. Las referencias 18 y 19 analizan cuestiones referentes al ensayo de estabilidad de vacunas conjugadas Hib.

Por consiguiente, tiene que controlarse la hidrólisis de los glucoconjugados en sacárido libre (es decir, no conjugado) en las vacunas formuladas solas o cuando están en combinación con otras vacunas. Este análisis requiere típicamente la separación de cualquier sacárido no conjugado del conjugado seguido por análisis cuantitativo de sacáridos. Los procedimientos conocidos de separación incluyen ultrafiltración, cromatografía hidrófoba y precipitación selectiva [20].

Un objeto de la invención es proporcionar modificaciones y mejoras en el control de calidad de vacunas conjugadas para evaluar su estabilidad e integridad. En particular, un objeto es proporcionar técnicas de separación mejoradas previas al análisis cuantitativo.

Divulgación de la invención Los inventores han descubierto que los sacáridos conjugados pueden precipitarse selectivamente de los sacáridos no conjugados con un reactivo básico en condiciones básicas. En estas condiciones, el sacárido no conjugado permanece sustancialmente en el sobrenadante mientras que el sacárido conjugado precipita de forma sustancialmente completa, permitiendo de este modo una separación rápida y cuantitativa de estos sacáridos que puede explotarse en procedimientos analíticos para cuantificar un sacárido no conjugado. La referencia 20 describe la precipitación selectiva de sacáridos no conjugados libres de sacáridos conjugados en vacunas conjugadas de polisacáridos de meningococo-toxoide diftérico usando desoxicolato/HCl en condiciones ácidas. Sin embargo, se ha descubierto que este enfoque está limitado, ya que los sacáridos capsulares bacterianos que contienen restos de ácido siálico, especialmente restos de ácido siálico terminales (por ejemplo, Streptococcus agalactiae) son susceptibles a hidrólisis en estas condiciones.

Los inventores también han descubierto que los sacáridos conjugados pueden precipitarse selectivamente del vehículo no conjugado usando el mismo reactivo y condiciones. Asimismo, el vehículo no conjugado permanece sustancialmente en el sobrenadante mientras que el sacárido conjugado precipita de forma sustancialmente completa, permitiendo de este modo una separación rápida y cuantitativa de estos componentes que puede explotarse en procedimientos analíticos para cuantificar un vehículo no conjugado (y por lo tanto puede usarse para cuantificar un sacárido no conjugado) .

La invención supera las deficiencias de la técnica previa y proporciona una técnica rápida y cuantitativa para la separación de componentes no conjugados y conjugados. La invención es aplicable a una gama de vacunas conjugadas, incluyendo vacunas que comprenden sacáridos capsulares bacterianos que contienen un resto de ácido siálico y particularmente vacunas que comprenden el sacárido capsular de Streptococcus agalactiae.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se emplea un reactivo básico en condiciones básicas para separar un sacárido conjugado de un componente no conjugado, como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para separar un componente de sacárido conjugado en una muestra de un componente no conjugado en la muestra, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra, donde el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11. La invención también proporciona el uso de un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente un componente de sacárido conjugado en una muestra de un componente no conjugado en la muestra, separando de este modo el componente de sacárido conjugado del componente no conjugado, donde el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacáridovehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una muestra que comprende un componente de sacárido conjugado y un componente no conjugado para el análisis de su grado de no conjugación, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra y obtener de este modo un sobrenadante que comprenda el componente no conjugado separado, donde el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11. La invención también proporciona un procedimiento para analizar el grado de no conjugación de una muestra que comprende un componente de sacárido conjugado y un componente no conjugado, que comprende las etapas de (i) poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra y obtener de este modo un sobrenadante que comprenda el componente no conjugado separado y (ii) analizar el contenido del sobrenadante para dar el contenido no conjugado de la muestra, donde el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para proporcionar una vacuna para su distribución a y/o uso por médicos, que comprende las etapas de: (a) fabricar una vacuna que comprende un sacárido conjugado; (b) analizar el grado de la vacuna de no conjugación por... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para analizar el grado de no conjugación de una muestra que comprende un componente de sacárido conjugado y un componente no conjugado, que comprende las etapas de (i) poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra y obtener de este modo un sobrenadante que comprende el componente no conjugado separado y (ii) analizar el contenido del sobrenadante para dar el contenido no conjugado de la muestra, en el que el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

2. Un procedimiento para preparar una muestra que comprende un componente de sacárido conjugado y un componente no conjugado para el análisis de su grado de no conjugación, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra y obtener de este modo un sobrenadante que comprende el componente no conjugado separado, en el que el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el componente no conjugado es un componente de sacárido no conjugado y/o el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de medir el contenido total de sacárido de la muestra.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el componente no conjugado es un componente de vehículo no conjugado y/o el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de medir el contenido total de vehículo de la muestra.

5. Un procedimiento para separar un componente de sacárido conjugado en una muestra de un componente no conjugado en la muestra, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente el componente de sacárido conjugado de la muestra, en el que el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

6. El uso de un reactivo básico en condiciones básicas para precipitar selectivamente un componente de sacárido conjugado en una muestra de un componente no conjugado en la muestra, separando de este modo el componente de sacárido conjugado del componente no conjugado, en el que el componente de sacárido conjugado es un conjugado sacárido-vehículo unido covalentemente, el sacárido conjugado se precipita selectivamente del sacárido no conjugado con el reactivo básico en condiciones básicas, y las condiciones básicas son de pH 9 a 11.

7. EL procedimiento de la reivindicación 5 o uso de la reivindicación 6, en el que el componente no conjugado es un 35 componente de sacárido no conjugado o un componente de vehículo no conjugado.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 7 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que el reactivo básico comprende una sal liotrópica que es K2HPO4.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 7 a 8 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que las condiciones básicas son de pH 9, 5 a 9, 9 y opcionalmente el reactivo básico comprende K2HPO4.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 7 a 9 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el sacárido conjugado es un antígeno sacárido conjugado con una proteína vehículo.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 7 a 10 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la muestra es una vacuna, particularmente una vacuna de glucoconjugado, más 45 particularmente una vacuna de glucoconjugado que comprende un conjugado que comprende un sacárido que contiene un resto de ácido siálico o una vacuna de glucoconjugado que comprende un conjugado que comprende un sacárido capsular bacteriano de Streptococcus agalactiae, por ejemplo, de Streptococcus agalactiae serogrupo Ia, Ib, II, III o V.

12. Un procedimiento de liberización de una vacuna para su uso por médicos, que comprende las etapas de: (a)

fabricar una vacuna que comprende un sacárido conjugado; (b) analizar el grado de no conjugación de la vacuna por un procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2; y, si los resultados de la etapa (b) indican un grado de no conjugación aceptable para uso clínico, (c) liberar la vacuna para su uso por médicos.

13. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna, que comprende una etapa de analizar el grado de no conjugación de la vacuna por un procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, incluyendo una etapa de 55 medición del pH, seguida por una etapa de ajuste del pH de la composición a un valor deseado, por ejemplo, entre 6 y 8, o aproximadamente 7.

14. Un procedimiento para envasar una vacuna, que comprende las etapas de: (a) fabricar una vacuna a granel que contiene un sacárido conjugado; (b) analizar el grado de no conjugación de la vacuna a granel por un procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2; (c) opcionalmente, analizar la vacuna a granel para el pH y/u otras propiedades; y, si los resultados de la etapa (b) y (c) indican que la vacuna a granel es aceptable para uso clínico,

(d) preparar y envasar la vacuna para uso humano a partir del granel.