SAPONINAS TRITERPÉNICAS PROCEDENTES DEL CORMO DE CROCUS SATIVUS COMO ADYUVANTE EN FORMULACIONES DE VACUNAS PROTEICAS.

Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de Crocus Sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas proteicas.

La presente invención se refiere a unas nuevas saponinas triterpénicas procedentes del cormo del azafrán (Crocus sativus L.), a una composición que las comprende, a su uso como sustancias adyuvantes en vacunas proteicas así como en la elaboración de medicamentos, preferiblemente para el tratamiento del cáncer y más preferiblemente para el tratamiento del carcinoma cervical, y a un método de obtención de las mismas. El empleo de estas saponinas triterpénicas como adyuvantes en vacunas deriva en una respuesta inmune incrementada, funcional y duradera frente al antígeno, superior a la de otras sustancias con capacidad inmunopotenciadora tales como las sales de aluminio, IFA (adyuvante incompleto de Freund), CpG (secuencias cortas de DNA bacteriano de citosina, fosfato y guanina) e incluso otras saponinas como QuilA, sin presentar los efectos adversos que habitualmente se observan bajo la administración de estos otros adyuvantes.

Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de Crocus sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas proteicas.

La presente invención se encuadra en el campo de la inmunología y de la farmacia, y específicamente se refiere a unas nuevas saponinas triterpénicas procedentes del cormo del azafrán (Crocus sativus L.) , a una composición que las comprende, a su uso como sustancias adyuvantes en vacunas proteicas y a un método de obtención de las mismas. El empleo de estas saponinas triterpénicas como adyuvantes en vacunas deriva en una respuesta inmune incrementada, funcional y duradera frente al antígeno.

Estado de la técnica anterior Crocus sativus o azafrán es una planta conocida por sus estigmas desecados ya que éstos constituyen una de las especias más caras del mundo (también conocida como azafrán) . A pesar de los muchos estudios científicos que se han realizado con los estigmas, debido a su alto valor agronómico, pocos estudios se han llevado a cabo en otras partes de la planta. Dentro de estos pocos, en el cormo de azafrán (el órgano reproductivo de esta planta) se ha descrito la presencia de una fracción cromatográfica en fase reversa (C4) , que además de presentar actividad antitumoral contra varias líneas celulares provoca, como se ha determinado en otros estudios, la activación de macrófagos mediante liberación de óxido nítrico (NO) bajo dosis no tóxicas. En un primer momento, la bioactividad se atribuyó a la presencia de un proteoglicano en esta fracción (Escribano, et al., Planta Médica, 2000, 66 (2) :157-62) . Posteriormente, se demostró que esta fracción estaba compuesta por un 5% de proteínas y un 95% de saponinas triterpénicas.

Actualmente, existe en el campo de la inmunología un interés creciente en la búsqueda de nuevas sustancias con actividad adyuvante/inmunopotenciadora. Los adyuvantes son sustancias que, usadas en combinación con el antígeno vacunal, logran superar los niveles de inmunidad alcanzados con el empleo del antígeno solo. Los adyuvantes, por tanto, son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Por lo que gracias a su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos.

Los avances experimentados en la última década en la síntesis de péptidos, la secuenciación de nucleótidos y la ingeniería genética han posibilitado el desarrollo de las denominadas “vacunas de nueva generación”; sin embargo, la aplicación exitosa de estas nuevas vacunas requiere de un esfuerzo de investigación sostenido encaminado a descubrir sustancias con actividad inmunopotenciadora (adyuvantes) , eficaces en la estimulación de la respuesta inmune y desprovistas de propiedades biológicas adversas (Grupta, et al., 1993, Vaccine, 11:293-306) , ya que en la mayoría de los casos su inclusión en la vacuna es indispensable para lograr niveles significativos de respuestas inmunes específicas de antígeno.

Desde el punto de vista de su origen, naturaleza química y actividad biológica específica, los adyuvantes constituyen una familia muy heterogénea de compuestos, a los que se les atribuyen funciones fundamentales:

1. La estimulación de la resistencia no específica del huésped contra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y,

2. La potenciación de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de antisueros.

Respecto al mecanismo de acción de estas sustancias, es muy variado, siendo uno de los más importantes el llamado “efecto depot”, por el que los adyuvantes de aluminio, las emulsiones oleosas y los liposomas o microesferas mantienen el antígeno atrapado en el sitio de la administración, impidiendo su liberación masiva y permitiendo un estímulo inmune prolongado.

Las investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente todos los adyuvantes activan los macrófagos (Guerrero & Gattas, 1982, Revista de Microbiología, 13 (2) :110-115) ; que al ser activados estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antígeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentación a los linfocitos. El macrófago también libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferación de los linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar específicamente sobre los linfocitos; pero, en general, éstos funcionan mejor si facilitan la liberación simultánea del antígeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido linfoide.

El número de productos naturales y derivados de la síntesis química con propiedades adyuvantes/inmunopotenciadoras es cada vez mayor. Sin embargo, sigue siendo necesario encontrar una sustancia con una adecuada relación eficiencia/seguridad. Así, aunque se conoce que los adyuvantes completo e incompleto de Freund (FCA y FIA) presentan una marcada toxicidad, han sido utilizados durante más de 50 años y aún son empleados con frecuencia en el campo de la investigación cuando se dispone de cantidades limitadas de antígenos o cuando éstos presentan una reducida inmunogenicidad (US 2003124709 A1) . Para las vacunas veterinarias, los adyuvantes más ampliamente utilizados son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) (US 5109026 A) , que si bien inducen una fuerte respuesta inmune presentan efectos no deseados, y las sales de aluminio (hidróxido y fosfato de aluminio) (US 2009/0202590 A1) . También se emplean liposomas, la toxina colérica, la vitamina E, los complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) , el monofosforil-lípido A derivado de bacterias o las saponinas, como QuilA o QS21, o incluso una combinación de estos dos últimos (US 7147862 B1) , así como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal.

Respecto a la selección de adyuvantes para vacunas de uso humano, el criterio más importante es la bioseguridad y, en la práctica, los compuestos de aluminio son los más empleados. Otros compuestos empleados son los polisacáridos naturales y algunos derivados obtenidos por hidrólisis o modificación química, como los glucanos aislados de la pared celular de levaduras, el J-carragenano y el sulfato de dextrano.

Los adyuvantes se pueden clasificar como inmunoestimuladores, los cuales presentan un efecto estimulador directo sobre las células del sistema inmune, o como “vehículos”, si funcionan como portadores que facilitan el transporte y presentación del antígeno al sistema inmune. Adicionalmente, algunos adyuvantes pueden funcionar por una combinación de estos mecanismos. Los adyuvantes específicos se pueden utilizar para conducir una respuesta inmune hacia una característica particular deseada. Teóricamente, se han establecido dos tipos principales de mecanismos inmunes efectores. Uno es una respuesta predominantemente humoral, caracterizada por la generación de citoquinas y anticuerpos de tipo Th2; y el otro es una respuesta inmune predominantemente mediada por células, caracterizada por la generación de citoquinas de tipo Th1 y de células T citotóxicas. Sin embargo, en la práctica lo que se observa generalmente es un equilibro entre los dos tipos de respuesta, describiéndose cualquier respuesta dada como predominantemente humoral (tipo Th2) o como predominantemente mediada por células (tipo Th1) . Así, para cualquier patógeno particular, si se desea que una vacuna induzca una respuesta inmune de tipo Th1 predominantemente, entonces la vacuna debería formularse con un adyuvante conocido que induzca respuestas tipo Th1. Uno de los adyuvantes que se conoce por inducir un equilibrio entre las respuestas inmunes humoral y mediada por células, que puede incluir una potente respuesta mediada por células y también una potente respuesta humoral, son las saponinas procedentes de Quijalla saponaria. La fracción QS21, derivada de la mezcla de saponinas QuilA, es la fracción de saponinas de Q. saponaria más conocida y ampliamente utilizada como adyuvante en la preparación de vacunas (US 5057540 A) .

Se ha demostrado que QS21 induce citoquinas Th1 y anticuerpos de isotipo IgG2a en ratones, lo cual es consistente con una respuesta de tipo Th1. Las saponinas se integran en las membranas celulares a través de su interacción con el colesterol, resultando en la formación de poros por donde el antígeno puede entrar. Posteriormente, los péptidos de esos antígenos pueden ser procesados y presentados vía complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) ,... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula general (I) :

donde R1 se selecciona de entre los siguientes grupos: yR2 representa el siguiente grupo:

o cualquiera de sus isómeros o sus sales.

2. Compuesto según la reivindicación 1 donde el isómero es el ácido 3-O-β-D-glucuronopiranosil-equinocístico28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

3. Compuesto según la reivindicación 1 donde el isómero es el ácido 3-O-β-D-galacturonopiranosil-equinocístico28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

4. Composición que comprende un compuesto de fórmula general (I) o cualquiera de sus isómeros o sus sales.

5. Composición según la reivindicación 4 donde el isómero es el ácido 3-O-β-D-glucuronopiranosil-equinocístico28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

6. Composición según la reivindicación 4 donde el isómero es el ácido 3-O-β-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

7. Composición según la reivindicación 4 que comprende los isómeros ácido 3-O-β-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil- (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido y ácido 3-O-β-Dgalacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil- (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

8. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones1a3 para la elaboración de un medicamento.

9. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

10. Uso del compuesto según la reivindicación 9 donde el cáncer es carcinoma cervical.

11. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones1a3 como adyuvante para una vacuna.

12. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones4a7 para la elaboración de un medicamento.

13. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones4a7para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

14. Uso de la composición según la reivindicación 13 donde el cáncer es carcinoma cervical.

15. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones4a7 como adyuvante para una vacuna.

16. Composición farmacéutica que comprende al menos el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a3.

17. Composición farmacéutica que comprende al menos ácido 3-O-β-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-α-L-ramnopiranosil- (1→2) -[4

O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido y ácido 3-O-β-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[β-D-galactopiranosil- (1→2) -α-L-arabinopiranosil- (1→2) -[β-D-xilopiranosil- (1→4) ]-αL-ramnopiranosil- (1→2) -[4-O-di-α-L-ramnopiranosil-3, 16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-β-D-fucopiranósido.

18. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que además comprende otro principio activo.

20. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 que además comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un antígeno.

21. Método de obtención de una composición según la reivindicación 7 que comprende:

a. separar la epidermis del cormo de Crocus Sativus,

b. liofilizar la epidermis obtenida en el paso (a) ,

c. extraer las saponinas de la epidermis del paso (b) mediante isopropanol:agua 1:1,

d. concentrar el producto obtenido en el paso (c) mediante vacío, hasta obtener un producto oleoso y resuspenderlo en metanol hasta obtener una proporción producto oleoso:metanol 7:3,

e. precipitar la suspensión obtenida en el paso (d) con acetona,

d. repetir los pasos (d) y (e) tres vesces más, y

g. fraccionar el precipitado obtenido en el paso (f) mediante cromatografía.

22. Método según la reivindicación 21 donde la cromatografía del paso (g) se realiza mediante una primera elución isocrática seguida de un gradiente de acetonitrilo.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22 donde la cromatografía del paso (g) se realiza mediante una primera elución isocrática seguida de un gradiente de acetonitrilo y una segunda elución en gradiente.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 donde la cromatografía del paso (g) consiste en una cromatografía semipreparativa en fase reversa HPLC en columna C18.

25. Método de obtención del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende todos los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 y además:

h. separar el producto obtenido en el paso (g) mediante cromatografía en capa fina.