Procedimiento y kit para determinar la administración de estradiol al ganado.

Se divulga un procedimiento para determinar la administración exógena del 17{be}-estradiol a animales bovinos, basado en la determinación del péptido D-piroglutamil-L-fenilalanina en el suero de dichos animales. La presencia de dicho péptido en concentraciones superiores a las de los animales control indica la administración exógena de 17{be}-estradiol o un éster del mismo. También se proporciona un kit que comprende dicho péptido y que facilita la determinación. El procedimiento puede llevarse a cabo por diversas técnicas, tales como separación cromatográfica acoplada a espectrometría de masas, o técnicas de inmunoanálisis tales como ELISA.

Procedimiento y kit para determinar la administración de estradiol al ganado.

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere al campo de la detección de sustancias en muestras tomadas de seres vivos que sirvan como marcadores de la administración o ingesta de alguna sustancia que se considere ilegal o que no deba administrarse por encima de unos determinados niveles. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento para determinar la administración exógena del 171-estradiol a animales bovinos, así como a un kit preparado específicamente para tal fin.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Como cualquier otro animal, los animales destinados a la alimentación (ganado vacuno, porcino, ovino, aves de corral, peces...) sufren enfermedades que requieren la administración de medicamentos para su prevención o tratamiento. Estos medicamentos pueden dar lugar a residuos que permanecen en los productos alimenticios derivados de estos animales (carne, leche, huevos...) .

Para garantizar la protección del consumidor, la Unión Europea ha establecido unos límites máximos de residuos (MRL) para algunas sustancias y, en algunos casos, ha prohibido su uso. Concretamente, la administración de hormonas esteroideas con acción estrogénica, androgénica o progestagénica, tanto con fines reproductivos como para promover el crecimiento del ganado, está prohibida por la Directiva 96/22/ECC. Sin embargo, sigue produciéndose, especialmente en los casos de producción intensiva de animales estabulados, donde se procura acelerar y mejorar el crecimiento de los animales, disminuyendo con ellos los tiempos de engorde y, en consecuencia, los costes de alimentación del ganado.

El 171-estradiol (conocido también simplemente como estradiol, oestradiol o también como E2, debido a la presencia de dos grupos hidroxilo en su estructura molecular) es una hormona esteroide femenina natural, que se puede considerar el estrógeno predominante durante la etapa reproductiva femenina, siendo el que presenta mayor concentración en suero. Durante la menopausia sigue estando presente, aunque los niveles de estrona son entonces superiores. También está presente en los hombres, en los que aparece como metabolito de la testosterona. Su fórmula es la siguiente:

Recientes evidencias respecto al uso de 171-estradiol indican que se debe considerar un carcinógeno completo, pues tiene capacidad tanto de iniciar tumores como de promoverlos. Por ello, y dado que existen productos alternativos en el mercado, en 2008 se prohibió permanentemente el uso de 171-estradiol y sus derivados tipo éster, incluso para uso terapéutico, mediante la Directiva 2008/97/EC. Sin embargo, la progesterona, un compuesto que se ha suministrado a menudo asociado al estradiol en la cría de animales, sigue estando permitida para uso terapéutico y tratamientos zootécnicos.

La administración exógena de hormonas naturales, tales como el 171-estradiol, progesterona, testosterona y algunos compuestos que dan lugar a las mismas al ser metabolizados por el propio organismo (prohormonas) , ha sido siempre complicada de determinar, porque dichas hormonas se encuentran en el cuerpo de manera natural, producidas por el organismo como parte de su metabolismo endógeno, de manera que estos compuestos se encuentran siempre presentes en las muestras tomadas de los animales, haya o no habido administración ilegal de los mismos. Así, la simple presencia de estas sustancias no ha podido utilizarse para confirmar una administración exógena fraudulenta. También es difícil poder determinar la administración exógena de derivados tipo éster de dichos compuestos, especialmente en muestras de tejidos o fluidos corporales, porque son rápidamente metabolizados, dando lugar a compuestos con la estructura de los esteroides naturales (Stolker et al., 2009) . El establecimiento de niveles de referencia, cuya superación indicaría una administración de hormonas esteroideas o de prohormonas, ha demostrado ser difícil, no sólo porque los niveles de concentración de los esteroides naturales en los animales es muy variable, estando influenciada por múltiples factores internos y externos, sino porque, además, se ha encontrado que el tratamiento con testosterona o estradiol de bovinos da lugar a concentraciones iguales o menores en plasma de estos compuestos (Simontacchi et al., 2004; Scippo et al., 1994) .

La cuantificación de moléculas sintetizadas en respuesta a estrógenos circulantes, como puede ser la vitelogenina, ha demostrado ser factible mediante el análisis de péptidos testigo, tal como se divulga por ejemplo en la solicitud US 2009/0011447. Los péptidos considerados como posibles candidatos a péptidos testigo se eligen entre los péptidos que resultan de la digestión de la propia proteína que se quiere analizar, por lo que la secuencia de los péptidos testigo finalmente elegidos coincide necesariamente con fragmentos de la secuencia de la proteína a determinar, siendo la digestión enzimática una etapa necesaria para llevar a cabo el método de la solicitud US 2009/0011447 en las muestras de peces que se quieren analizar. Dada la naturaleza esteroidea del estradiol, la progesterona o la testosterona, las estrategias análogas no parecen directamente aplicables.

Así, aunque se han desarrollado diversos métodos analíticos para detectarlas, aún sigue siendo un reto el diseño de procedimientos adecuados para demostrar la administración de hormonas de origen natural. Existe la necesidad, por tanto, de desarrollar métodos que permitan discriminar, de forma inequívoca, entre la presencia de dichas hormonas (o sus metabolitos) de forma natural y su presencia como consecuencia de una administración ilegal. Preferiblemente, el método debería ser aplicable a muestras fáciles de tomar, tales como el suero y la orina.

La presente invención proporciona una solución a este problema.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el hallazgo de que el suero sanguíneo de animales tratados con estradiol presentan un metabolito de bajo peso molecular que parece ser característico de dichos animales, mostrando una relación de 0, 08 entre la intensidad del correspondiente ion entre los animales sin tratar y los animales tratados. La dilucidación de su estructura permitió averiguar que se trata del dipéptido D-piroglutamil-L-fenilalanina (D-Pyr-L-Phe) . El compuesto es detectable, por ejemplo, acoplando técnicas de separación como las de cromatografía de alta resolución (como puede ser la cromatografía de gases) a técnicas de detección como la espectroscopía de masas.

Por tanto, la determinación de la concentración del péptido en el suero de ganado vacuno, y su comparación con la concentración en el suero de animales control, permite determinar si a un animal se le ha suministrado o no 171-estradiol de forma artificial, pues los animales a los que se les haya suministrado 171estradiol presentarán un aumento significativo de la concentración de dicho dipéptido.

Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para determinar la administración exógena a animales bovinos de 171-estradiol o un éster del 171-estradiol que comprende las etapas de:

a) determinar la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina en una muestra de suero tomada del bovino en estudio;

b) comparar dicha concentración con un valor de referencia obtenido de muestras de suero de bovinos control que no han recibido 171-estradiol;

c) concluir que ha habido administración exógena de 171-estradiol o un éster del mismo si el incremento de D-piroglutamil-L-fenilalanina en el suero del bovino en estudio respecto al valor de referencia es significativo.

Preferiblemente, los bovinos control que se utilicen para obtener el valor de referencia serán de la misma especie, más preferiblemente de la misma raza, y del mismo sexo.

La determinación de la concentración del dipéptido puede realizarse por un método análogo al seguido para su identificación por biomarcador (filtrado del suero y determinación de la presencia del dipéptido mediante HPLC-MS/MS) , o mediante cualquier otro método alternativo conocido por los expertos en la materia como puede ser su detección mediante, por ejemplo, técnicas de ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) , o separación cromatográfica y detección por cualquier otro método alternativo a la MS/MS.

Sea cual sea el método de detección, su aplicación requerirá (o hará aconsejable) el uso del dipéptido como estándar interno. Por... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la administración exógena d.

17. estradiol o un éster de.

17. estradiol a animales bovinos que comprende las etapas de:

a) determinar la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina en una muestra de suero sanguíneo tomada del bovino en estudio;

b) comparar dicha concentración con un valor de referencia obtenido de muestras de suero de bovinos control, que no han recibid.

17. estradiol o un éster del mismo;

c) concluir que ha habido administración exógena d.

17. estradiol o un éster del mismo si el incremento de D-piroglutamil-L-fenilalanina en el suero del bovino en estudio respecto al valor de referencia es significativo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el bovino en estudio y los bovinos control son de la misma especie.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la especie de los bovinos es Bos taurus.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el bovino en estudio y los bovinos control son del mismo sexo.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el sexo es el femenino.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el bovino en estudio y los bovinos control están en edad reproductiva.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el bovino en estudio y los bovinos control son vacas.

8. Método según la reivindicación 7, en el que las vacas son de la raza Holstein.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de suero sanguíneo se somete a filtración para eliminar proteínas de alto peso molecular antes de determinar la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la determinación de la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina se realiza mediante técnicas de inmunoensayo.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina se determina mediante ELISA.

12. Método según la reivindicación 11, en el que se utiliza un anticuerpo primario que reconoce específicamente D-piroglutamil-L-fenilalanina, anticuerpo primario al que se une un anticuerpo secundario al cual está unida la enzima que genera un producto a partir de cuya concentración se determina la concentración de Dpiroglutamil-L-fenilalanina en la muestra en estudio.

13. Método según la reivindicación 9, en el que los componentes del suero se separan mediante cromatografía antes de determinar la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina .

14. Método según la reivindicación 13, en el que los componentes del suero se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía de gases de alta resolución.

15. Método según la reivindicación 14, en el que los componentes del suero se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas.

16. Método según la reivindicación 15, en el que se utiliza espectrometría de masas en tándem.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que se utiliza como patrón el dipéptido D-piroglutamil-L-fenilalanina.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la concentración de D-piroglutamil-L-fenilalanina en la muestra se determina a partir de la intensidad de la señal del ion que coincida en relación masa/carga (m/z) y tiempo de retención con la correspondiente al patrón de D-piroglutamil-L-fenilalanina.

19. Método según la reivindicación 18, en el que se utiliza espectroscopía de masas en tándem, en la que el patrón D-piroglutamil-L-fenilalanina se infunde directamente en la fuente de ionización electrospray (ESI) y se controlan transiciones de ion padre a ion hijo, verificando la presencia en la muestra de suero del bovino en estudio de un ion de m/z 277 como ion característico en ESI (+) y la aparición de al menos tres iones hijos de valores de m/z 120, 166 y 231.

20. Un kit para determinar la administración exógena a animales bovinos d.

17. estradiol o un éster de.

17. estradiol, caracterizado por que comprende D-piroglutamil-L-fenilalanina.

21. Kit según la reivindicación 20, que comprende adicionalmente un anticuerpo específico para el dipéptido D-piroglutamil-L-fenilalanina.

22. Kit según la reivindicación 21, que comprende adicionalmente un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo específico para el dipéptido D-piroglutamil-L-fenilalanina.

23. Kit según la reivindicación 21 ó 22, en el que el anticuerpo específico o, de estar presente, el anticuerpo secundario, está unido a una enzima.

24. Kit según la reivindicación 23, que adicionalmente comprende un sustrato de la enzima que es 10 transformado por la misma en un producto fácilmente diferenciable del sustrato.

25. Kit según la reivindicación 24, en el que el producto se diferencia del sustrato por su color.

26. Kit según la reivindicación 24, en el que el producto se diferencia del sustrato por emitir luz.

27. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, que adicionalmente comprende una solución

tampón en la que la enzima es activa o una solución que, tras dilución, da lugar a una solución tampón en la que la 15 enzima es activa.

t[1]

Fig. 1

t[1]

Fig. 1 (cont.)

Fig. 3

A

NL:2.40E5m/z=277.10

277.14

Fig. 4

NL:6.67E4m/z=277.10

277.14

Fig. 4 (cont.)

Intensidad (cps)

Fig. 7

B Max: 240.0 cps

Intensidad (cps)

Tiempo (minutos)

Fig. 8 (cont.)

Max: 60.0 cps

Intensidad (cps)

Tiempo (minutos)

Fig. 8 (cont.)

Intensidad (cps)

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201132122

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 28.12.2011

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

58. 587; todo el documento. 1-27 A US 20110183925 A1 (SATO, K. et al.) 28.07.2011, todo el documento, especialmente párrafos [0019], [0104], tabla 2. 1-27 A US 20090011447 A1 (BANOUB, J.H. et al.) 08.01.2009, todo el documento. 1-27 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 28.03.2012 Examinador M. Novoa Sanjurjo Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201132122

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD G01N33/68 (2006.01)

G01N33/74 (2006.01) C07K5/06 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

G01N, C07K

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, REGISTRY, HCAPLUS

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201132122

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.03.2012

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones:

La invención consiste en un método para determinar la administración exógena de 17º-estradiol a animales bovinos, en la que se determina la presencia y concentración en suero del dipéptido D-Pyr-L-Phe.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201132122

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

58. 587; todo el documento. D02 US 20110183925 A1 (SATO, K. et al.) 28.07.2011 D03 US 20090011447 A1 (BANOUB, J.H. et al.) 08.01.2009

El documento D01, describe la identificación de péptidos N-y-glutamil-, N-piroglutamil-y N-lactoil-durante el proceso de maduración del queso Parmigiano-Reggiano. Entre los péptidos identificados está el dipéptido D-Pyr-L-Phe (ver figura 5) . Los péptidos identificados se relacionan con el sabor y podrían utilizarse para valorar la calidad del queso. El documento D02, describe la actividad del péptido L-Pyr-L-Phe como antiinflamatorio El documento D03, describe la cuantificación de vitelogenina, proteína sintetizada en respuesta a la presencia de estrógenos circulantes en animales ovíparos, mediante el análisis de péptidos testigo que se eligen entre los péptidos que resultan de la digestión con tripsina. La cuantificación se realiza con la vitelogenina plasmática de la trucha arcoiris, el salmón atlántico y el bacalao atlántico.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA

Reivindicaciones 1-27

No se ha encontrado en el estado de la técnica, ningún documento que relacione la presencia en suero de animales del dipéptido D-Pyr-L-Phe, con la administración d.

17. estradiol. Dicho dipéptido solamente ha sido identificado previamente en el queso Parmigiano-Reggiano y se relaciona en este caso con uno de los compuestos responsables del sabor del producto e indicador del grado de maduración del mismo. El dipéptido Pyr-L-Phe, ha sido descrito en el documento D02, como antiinflamatorio, pero en este caso se trata del isómero en el que el ácido piroglutámico está en la forma L. Por tanto, se considera que los documentos citados solo muestran el estado general de la técnica y no se consideran de particular relevancia, ya que para una persona experta en la materia no sería obvio aplicar las características de los documentos citados y llegar a la invención tal como se contempla en las reivindicaciones. Por tanto, el objeto de la presente solicitud, cumple los requisitos de novedad y actividad inventiva de acuerdo a los Art. 6 y 8 de la LP.

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