PREPARACIÓN DE MEZCLAS LÍQUIDAS.

Un método para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada:

- un amortiguador de pH. - un ácido o una base, - un disolvente, y opcionalmente - una sal, para proporcionar una mezcla líquida de pH y fuerza iónica predefinidos, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando la ecuación de Debye-Hückel, en el que el parámetro del tamaño iónico a en la ecuación de Debye-Hückel se determina como la media ponderada del tamaño iónico de todas las especies que contribuyen a la fuerza iónica de la mezcla líquida, y en el que la fuerza iónica de cada especie se usa como parámetro de ponderación

Preparaci6n de mezclas liquidas Campo tecnico La presente invenci6n se refiere a un metodo para generar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica controlados, asi 5 como a un dispositivo aplicable a dicho metodo. La invenci6n es de interes general en cualquier situaci6n en la que se necesite una preparaci6n exacta de un amortiguador de pH.

Antecedentes La obtenci6n de liquidos de composici6n conocida de forma precisa es importante en muchos casos, como cuando se usan disoluciones tamp6n que tienen un pH, y opcionalmente tambien una fuerza i6nica, especificados. Ademas, en muchos casos, la composici6n del liquido no deberia solo ser conocida y controlada de forma precisa en cada momento, sino que tambien deberia variar con el tiempo de forma precisa y controlada.

Una aplicaci6n en la que la composici6n de los liquidos es de suma importancia es en cromatografia liquida y mas especificamente cuando la eluci6n, es decir la liberaci6n de moleculas diana aisladas de la matriz cromatografica, se realiza por eluci6n en gradiente. Por ejemplo, en cromatografia de intercambio i6nico, que es un metodo usado 15 frecuentemente para la separaci6n y purificaci6n de biomoleculas, se usa a veces eluci6n en gradiente, por ejemplo para encontrar las condiciones de eluci6n 6ptimas que permiten el diseno de un procedimiento industrial usando eluci6n escalonada. Como es bien conocido, el eluyente contiene entonces una sal inerte y el gradiente se realiza variando la concentraci6n de esta sal. Es bien conocido que un cambio en la concentraci6n de la sal, es decir en la fuerza i6nica, afecta tambien al pH, y ha sido bien documentado que el pH y la fuerza i6nica del eluyente son los dos parametros mas importantes que controlan la selectividad de las separaciones de proteinas en resinas de intercambio i6nico.

La patente estadounidense N° 5.112.949 (Vukovich) se refiere a un sistema automatico para realizar una separaci6n usando un gradiente. Un problema con dichos sistemas manuales y automaticos con gradientes que cambian gradualmente es que si el gradiente es suave toma mucho tiempo realizar la eluci6n y si el gradiente se hace brusco entonces en lugar de que las biomoleculas de interes sean eluidas una por una, se produciran solapamientos en la eluci6n de las biomoleculas. Esto lleva a que varias especies de biomoleculas sean recogidas en cada fracci6n en lugar de que cada especie de molecula se recoja en su propia fracci6n separada.

La patente estadounidense N° 7.138.051 (De Lamotte) se refiere a un sistema, metodo y software cromatografico para la separaci6n de biomoleculas. Mas especificamente, esta patente se refiere a la optimizaci6n de la separaci6n de biomoleculas eluidas de una columna cromatografica en la que la concentraci6n de un componente anadido a una disoluci6n tamp6n de eluci6n se varia con el fin de formar una disoluci6n tamp6n de eluci6n en la que la concentraci6n de dicho componente anadido varie gradualmente.

Okamoto (Hirokazu Okamoto et al., Pharmaceutical Research, Vol. 14, N° 3, 1997: Theor y and Computer Programs for Calculating Solution pH, Buffer formula and Buffer Capacity for Multicomponent System at a Given Ionic Strength

and Temperature) describe programas de ordenador para calcular el pH de la disoluci6n, la f6rmula del amortiguador de pH y la capacidad del amortiguador de pH para una fuerza i6nica y temperatura dadas. Sin embargo, los amortiguadores de pH preparados por Okamoto et al. muestran una variaci6n del pH que aumenta al aumentar la concentraci6n de la sal, incluso para concentraciones tan bajas como 0, 3M. Por lo tanto, los metodos de Okamoto no son suficientes para proporcionar disoluciones tamp6n de pH constante que tambien contengan una sal.

La forma tradicional de formaci6n de gradiente ha implicado la preparaci6n cuidadosa de eluyentes que comprenden sales inertes asi como disoluciones tamp6n de pH determinado previamente para producir un gradiente de fuerza i6nica a pH constante. La optimizaci6n de la separaci6n de las proteinas se ha realizado cambiando la pendiente del gradiente de la sal inerte y/o cambiando el sistema amortiguador de pH por uno con pH diferente.

En la tecnica anterior inicial, la optimizaci6n incluia la preparaci6n de numerosas disoluciones tamp6n con pH y 45 concentraciones salinas predeterminados que debian ser valoradas meticulosamente para que las separaciones fueran reproducibles. Obviamente, dichos metodos eran poco practicos y requerian mucho tiempo.

Los metodos para el calculo del pH de la disoluci6n tamp6n para fuerzas i6nicas moderadas (hasta 100mM) estan documentados en la bibliografia y se basan en la soluci6n algebraica o por ordenador de las ecuaciones de equilibrio entre las diferentes especies cargadas y no cargadas presentes en el amortiguador de pH.

50 Para una especie basica particular (que puede ser una base B o una base conjugada A-) en equilibrio con las especies acidas correspondientes (que pueden ser un acido conjugado BH+ o un acido HA, respectivamente) , el equilibrio se puede escribir:

H+ + especie basica < ==> especie acida+ Ec. 1.1

La constante de equilibrio, Ka, correspondiente se define como:

Ka = (H+) (especie basica) I (especie acida) Ec. 1.2

donde los parentesis indican las actividades de cada especie. Tomando logaritmos en ambos miembros de la ecuaci6n 1.2 y despejando el pH definido como -log (H+) se obtiene:

pH = pKa + log { (especie basica) I (especie acida) } Ec 1.3

que a veces se denomina ecuaci6n de Henderson-Hasselbach. La raz6n por la que se usan las actividades en la ecuaci6n 1.2 en lugar de las correspondientes concentraciones es que, debido a las interacciones electrostaticas, los iones implicados tienden a apantallarse en el medio. Sin embargo, mientras que las medidas de pH son observaciones directas de la actividad de los protones, generalmente son las concentraciones y no las actividades correspondientes las que se observan, por ejemplo por pesada, pipeteo o bombeo de sus cantidades y volumenes. La actividad de cada i6n se relaciona con la concentraci6n correspondiente mediante el coeficiente de actividad :

(especie) = [especie] Ec. 1.4

En el estado ideal de diluci6n infinita, se hace 1 y la actividad de cada i6n se hace igual a la concentraci6n correspondiente. Sin embargo, en los casos reales, la fuerza i6nica es diferente de 0 y los coeficientes de actividad de las diferentes especies se hace menor que 1.

Para estas desviaciones se ha desarrollado un modelo bien establecido en la denominada teoria de Debye Huckel, conocido como:

log = (AZ 2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) Ec. 1.5

donde A es una constante, o mas bien un parametro dependiente de la temperatura ∼0, 51. Usando datos bien conocidos, el valor de A se puede calcular exactamente como A = 0, 4918 + 0, 0007*T + 0, 000004*T 2 donde T es la temperatura en grados Celsius. Z es la carga del i6n y la cantidad a, el radio de los iones hidratados (en A) , se describe como la &quot;distancia media de aproximaci6n de los iones, positivos o negativos&quot; en el trabajo original de Debye y Huckel.

En una tabla presentada en el articulo de Kielland mencionado anteriormente se ha mostrado que este parametro, tambien conocido como el parametro del tamano i6nico, es diferente para especies i6nicas diferentes. I es la fuerza i6nica:

I = % (C iZi2) (incluidos todos los iones) Ec. 1.6

Ci es la concentraci6n y Zi es la carga del i6n presente en la disoluci6n (en unidades de carga electrica) .

Introduciendo la ecuaci6n 1.4 en la ecuaci6n 1.3 se obtiene el pH en funci6n de la concentraci6n en lugar de las actividades:

pH = pKa + log { b[especie basica] I ( a[especie acida]) } =

= pKa + log b - log a + log {[especie basica] I [especie acida]} =

= pKa' + log {[especie basica] I ([especie acida]} Ec. 1.7

donde:

pKa' = pKa+log b- log a Ec. 1.8

es un valor de pKa aparente que permite utilizar los valores medibles de las concentraciones de las diferentes especies del amortiguador de pH. El valor de pKa' puede calcularse introduciendo la ecuaci6n 1.5 en la ecuaci6n 1.8, dando:

pKa' = pKa + (A Za2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) (A Zb2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) Ec. 1.9

donde la introducci6n de los subindices a y b fue necesaria para especificar los parametros correspondientes al acido y la base. Por lo tanto:

1. Un metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada: -un amortiguador de pH. -un acido o una base, -un disolvente, y opcionalmente

- una sal, para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en el

que el parametro del tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, y en el que la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.

2. Un metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando un procedimiento iterativo. 1.

3. Un metodo segun la reivindicaci6n 2, en el que el procedimiento iterativo comprende:

(a) determinar las proporciones relativas de los componentes en la que la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida se refiere a las especies segun una distribuci6n predefinida entre las especies;

(b) basandose en las proporciones relativas de los componentes determinadas en la etapa precedente, calcular la fuerza i6nica de cada especie en la mezcla;

(c) determinar una nueva serie de proporciones relativas de los componentes, teniendo en cuenta la fuerza i6nica calculada en (b) , y (d) repetir las etapas (b) a (c) hasta que se obtiene el criterio de convergencia predeterminado.

4. Un metodo segun la reivindicaci6n 3, en el que, en la etapa (a) , la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida se refiere a las especies salinas.

5. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el parametro de tamano i6nico a de la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como:

en la que Ii es la fuerza i6nica y ai es el parametro de tamano i6nico de la especie i, e I es la fuerza i6nica total.

6. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el parametro de tamano i6nico a en la 30 ecuaci6n de Debye-Huckel se aproxima como:

= 5 * (masa) 1I3 + capa en la que &quot;capa&quot; se fija opcionalmente a un valor para una especie cargada positivamente y se fija a un valor diferente para una especie cargada negativamente, y opcionalmente se fija a un valor en el intervalo de 3, 8-4, 2, tal como 4, 0, para las especies i6nicas cargadas positivamente; y &quot;capa&quot; se fija a un valor en el intervalo de 0-0, 2, tal como 0, para las especies i6nicas cargadas negativamente.

7. Un metodo para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos, que comprende:

• proporcionar disoluciones madre de los componentes de al menos uno entre cada:

o un amortiguador de pH,

o un acido o una base,

o un disolvente, y opcionalmente o una sal • determinar la proporci6n relativa de cada disoluci6n madre del componente que se debe mezclar usando el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, • mezclar las disoluciones madre. .

8. Un metodo segun la reivindicaci6n 7, en el que la fuerza i6nica se cambia gradualmente combinando concomitantemente proporciones variables de las disoluciones madre del componente, y en el que el valor del pH del flujo liquido se mantiene esencialmente constante.

9. Un metodo segun las reivindicaciones 7 u 8, en el que se preparan dos o mas disoluciones madre de los componentes, cuyas disoluciones madre de los componentes comprenden diferentes especies amortiguadoras de pH.

10. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que se proporciona una disoluci6n madre del componente que comprende al menos dos especies amortiguadoras de pH.

11. Un procedimiento de selecci6n de alto rendimiento o un procedimiento de cromatografia liquida, en el que el amortiguador de pH se prepara como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10. 1.

12. Un programa de ordenador para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada: -un amortiguador de pH, -un acido o una base, -un disolvente, 20 y opcionalmente

- una sal, para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidas segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las proporciones de mezcla de un componente determinados se visualizan por un usuario para su evaluaci6n y/o se usan para controlar un dispositivo de mezcla de liquidos.

13. Un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH, que comprende: -un dispositivo de mezcla de liquidos que comprende un puerto de salida del liquido mezclado y varios puertos de entrada conectados con las fuentes de los componentes de al menos uno de:

o un amortiguador de pH,

o un acido o una base,

o un disolvente, y opcionalmente o una sal

- una unidad de control de la mezcla dispuesta para controlar las proporciones relativas de los componentes suministrados a traves de los puertos de entrada del dispositivo de mezcla que proporciona una mezcla liquida de

pH y fuerza i6nica predefinidos al puerto de salida, estando la unidad de control de la mezcla dispuesta para determinar las proporciones relativas de los componentes usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en la que el parametro del tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, donde la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.

14. Un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH segun la reivindicaci6n 13, que comprende al menos una valvula controlable o una bomba controlable para suministrar las proporciones relativas de al menos uno de los componentes.

15. Un sistema de cromatografia liquida que comprende un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.