Método de purificación de una inmunoglobulina a partir de agregados de inmunoglobulina,

que consta de las siguientes etapas: a) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón; b) poner en contacto la solución con un material de intercambio catiónico débil, en condiciones que permitan la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil; c) recuperar la inmunoglobulina monomérica del material de intercambio catiónico débil en una sola etapa, usando una solución que lleve una sustancia tampón y una sal, donde el material de intercambio catiónico débil es un material de intercambio catiónico débil carboximetílico, donde la inmunoglobulina es un miembro de la clase de las inmunoglobulinas G o E, donde la solución de la etapa de recuperación c) tiene un valor de pH comprendido entre 3,0 y 7,0. donde la sal de la etapa c) se escoge del grupo formado por cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, sales del ácido cítrico, sales del ácido fosfórico y mezclas de estos componentes, donde la sustancia tampón tiene un intervalo de concentración entre 5 mM y 100 mM

Método para purificar anticuerpos Alcance de la presente invención La presente invención se refiere al campo de la purificación de polipéptidos. En ella se describe un nuevo método para purificar inmunoglobulinas con una resina de intercambio iónico. Al mismo tiempo se indica un método para determinar rápidamente las condiciones de purificación.

Antecedentes de la presente invención Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas juegan un papel importante en el catálogo médico actual. Para el uso humano cualquier sustancia farmacéutica tiene que cumplir distintos criterios. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos en las personas hay que eliminar, sobre todo, ácidos nucleicos, virus y proteínas de la célula huésped capaces de causar daños graves. Para satisfacer la especificación reglamentaria hay que llevar a cabo una o más etapas de purificación tras el proceso de elaboración. La pureza, la productividad y el rendimiento tienen un papel importante en la definición de un proceso de purificación apropiado.

Para la purificación de proteínas hay varios métodos bien establecidos y generalizados, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (p.ej. cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G) , la cromatografía de intercambio iónico (p.ej. de intercambio catiónico (resinas carboximetílicas) , de intercambio aniónico (resinas aminoetílicas) y de intercambio iónico mixto) , la adsorción tiofílica (p.ej. con beta-mercaptoetanol u otros ligandos SH) , la cromatografía de interacción hidrófoba o de adsorción aromática (p.ej. con fenil-sefarosa, con resinas azaarenofílicas o con ácido m-aminofenilborónico) , la cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (p.ej. con material de afinidad de Ni (II) y Cu (II) ) , la cromatografía de exclusión de tamaños y métodos electroforéticos (como la electroforesis de gel, la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .

Necina, R. y otros, Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698, han informado de la captura de anticuerpos monoclonales humanos, directamente de sobrenadantes de cultivos celulares, mediante agentes de intercambio iónico con gran densidad de carga. En la patente WO 89/05157 se revela un método para purificar inmunoglobulinas, sometiendo directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio catiónico. Danielsson, A., y otros, J. Immun. Meth. 115 (1988) , 79-88, describen una purificación en una sola etapa de anticuerpos IgG a partir de ascitis de ratón.

Raweerith, R. y otros (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72) han empleado una combinación de métodos, a saber: precipitación con ácido caprílico y cromatografía de intercambio iónico, como medio para fraccionar anticuerpos equinos digeridos con pepsina, a fin de obtener antiveneno F (ab') 2. En la patente WO 2003/102132 se revela la combinación de una etapa de purificación por inafinidad y una filtración de flujo tangencial de gran rendimiento, para purificar proteínas. En la patente WO 92/19973 se divulga la combinación de dos etapas de cromatografía de afinidad.

Follman, D.K. y Fahrner, R.L. han publicado un análisis factorial de procesos de purificación de anticuerpos con el empleo de tres etapas cromatográficas sin proteína A (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85) . Mhatre, R. y otros (J. Chrom. A 707 (1995) 225-231) han investigado la purificación de fragmentos Fab de anticuerpo por cromatografía de intercambio catiónico y elución con gradiente de pH.

La patente WO 94/00561 revela anticuerpos monoclonales humanos anti-rhesus y líneas celulares para producirlos. En la patente WO 2004/024866 se expone un método para purificar un polipéptido por cromatografía de intercambio iónico, en el cual se usa un lavado con gradiente para separar el polipéptido deseado de uno o más contaminantes. Schwarz, A. y otros (Laborpraxis 21 (1997) 62-66) informan de la purificación de anticuerpos monoclonales con una columna CM-HyperD.

La patente WO 2004/076485 revela un proceso para purificar anticuerpos mediante proteína A y cromatografía de intercambio iónico. En la patente EP 0 530 447 se expone un proceso para purificar anticuerpos monoclonales IgG mediante una combinación de tres etapas cromatográficas. La eliminación de proteína A de las preparaciones de anticuerpo se indica en la patente US 4, 983, 722.

La patente WO 95/16037 revela la purificación de anticuerpos monoclonales biespecíficos anti-EGF-R/anti-CD3 de hibridoma híbrido, realizada mediante cromatografía de intercambio catiónico con proteína A. La separación de los anticuerpos monoméricos de sus multímeros, usando cromatografía de intercambio iónico, se expone en la patente EP 1 084 136. La patente US 5, 429, 746 se refiere a la aplicación combinada de la cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía de intercambio iónico para purificar moléculas proteicas de anticuerpo.

En la patente US 5, 118, 796 se revela una purificación eficiente a gran escala de inmunoglobulinas y derivados. La producción y purificación de anticuerpo antitetánico ovino es revelada por Redwan y otros (Redwan, El-R.M., y otros Comp. Immunol. Microbiol. & infect. Diseases 28 (2005) 167-176) .

Resumen de la presente invención Así, el objeto de la presente invención es proporcionar otro método para purificar inmunoglobulinas producidas por recombinación y separar las especies de inmunoglobulinas monoméricas y multiméricas.

La presente invención proporciona un método de purificación de una inmunoglobulina a partir de agregados de inmunoglobulina. El método consta de las siguientes etapas:

a) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón;

b) poner en contacto la solución con un material de intercambio iónico débil, en condiciones que permitan la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio iónico débil;

c) recuperar la inmunoglobulina monomérica del material de intercambio iónico débil en una sola etapa, usando una solución que lleve una sustancia tampón y una sal, donde el material de intercambio catiónico débil es un material de intercambio catiónico débil carboximetílico, donde la inmunoglobulina es un miembro de la clase de las inmunoglobulinas G o E, donde la solución de la etapa de recuperación c) tiene un valor de pH comprendido entre 3, 0 y 7, 0. donde la sal de la etapa c) se escoge del grupo formado por cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, sales del ácido cítrico, sales del ácido fosfórico y mezclas de estos componentes, donde la sustancia tampón tiene un intervalo de concentración entre 5 mM y 100 mM.

Descripción detallada de la presente invención En esta solicitud de patente se usan estos términos conforme a la siguiente definición: Tal como se usa en esta solicitud de patente, el término “resina de intercambio iónico” o “material de intercambio iónico” significa una matriz inmóvil de alto peso molecular que lleva sustituyentes cargados, unidos por enlace covalente. Para que la carga global sea neutra se unen, no covalentemente, contraiones a la matriz. El “material de intercambio iónico” tiene la capacidad de cambiar sus contraiones no unidos covalentemente por iones de carga similar de la solución circundante. Según la carga de sus contraiones intercambiables la “resina de intercambio iónico” se denomina resina de intercambio catiónico o resina de intercambio aniónico. Según la naturaleza del grupo cargado (sustituyente) la “resina de intercambio iónico” se denomina, p.ej., resina de ácido sulfónico (S) o resina carboximetílica (CM) en el caso de las resinas de intercambio catiónico. Según la naturaleza química del grupo/ sustituyente cargado la “resina de intercambio iónico” se puede clasificar adicionalmente como resina de intercambio iónico fuerte o débil, dependiendo de la fuerza del enlace covalente del sustituyente cargado. Por ejemplo, las resinas de intercambio catiónico fuerte tienen un grupo de ácido sulfónico como sustituyente cargado; las resinas de intercambio catiónico débil tienen un grupo carboxilo, preferentemente un grupo carboximetilo, como sustituyente cargado, y las resinas de intercambio aniónico débil tienen un grupo dietilaminoetilo como sustituyente cargado.

Las resinas de intercambio catiónico pueden adquirirse, bajo diversas marcas, de una serie de compañías, como p.ej.... [Seguir leyendo]

1. Método de purificación de una inmunoglobulina a partir de agregados de inmunoglobulina, que consta de las siguientes etapas:

a) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón; b) poner en contacto la solución con un material de intercambio catiónico débil, en condiciones que permitan la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil; c) recuperar la inmunoglobulina monomérica del material de intercambio catiónico débil en una sola etapa, usando una solución que lleve una sustancia tampón y una sal, donde el material de intercambio catiónico débil es un material de intercambio catiónico débil carboximetílico, donde la inmunoglobulina es un miembro de la clase de las inmunoglobulinas G o E, donde la solución de la etapa de recuperación c) tiene un valor de pH comprendido entre 3, 0 y 7, 0. donde la sal de la etapa c) se escoge del grupo formado por cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, sales del ácido cítrico, sales del ácido fosfórico y mezclas de estos componentes, donde la sustancia tampón tiene un intervalo de concentración entre 5 mM y 100 mM.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia tampón es ácido cítrico o una sal del mismo o ácido fosfórico o una sal del mismo.

20 3. Método según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque es cromatográfico o discontinuo.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el material de intercambio catiónico se procesa a valores de pH inferiores al punto isoeléctrico de dicha inmunoglobulina.

25 5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el valor del pH se mantiene constante en la etapa única.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha inmunoglobulina tiene un punto isoeléctrico (pI) de 6, 0 o más (pI ≥ 6, 0) . 30

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la sal eluyente de la etapa c) es al mismo tiempo la sustancia tampón.

CMSefarosa Choque de elución 03:1_Conc

CMSefarosa Choque de elución 03:1_UV1_280 nm CMSefarosa Choque de elución 03:1_Fracciones CMSefarosa Choque de elución 03:1_pHCMSefarosa Choque de elución 03:1_Cond CMSefarosa Choque de elución 05:1_UV1_280 nm CMSefarosa Choque de elución 05:1_Conc CMSefarosa Choque de elución 05:1_pHCMSefarosa Choque de elución 05:1_Fracciones CMSefarosa Choque de elución 05:1_Cond CMSefarosa Choque de elución 02:1_UV1_280 nm CMSefarosa Choque de elución 02:1_Conc CMSefarosa Choque de elución 02:1_pHCMSefarosa Choque de elución 02:1_Fracciones CMSefarosa Choque de elución 02:1_Cond CMSef Choque de elución 1 cm CpH40:1_UV1_280 nm CMSef Choque de elución 1 cm CpH40:1_Conc CMSef Choque de elución 1 cm CpH40:1_pHCMSef Choque de elución 1 cm CpH40:1_Fracciones CMSef Choque de elución 1 cm CpH40:1_Cond CMSef Choque de elución pH601:1_UV1_280 nm CMSef Choque de elución pH601:1_Conc CMSef Choque de elución pH601:1_pHCMSef Choque de elución pH601:1_Fracciones CMSef Choque de elución pH601:1_Cond

Salida Salida

Eluato F6 Eluato F6

Eluato F2 Eluato F2

Residuo Herceptina CM5001:1_UV1_280 nm Herceptina CM5001:1_UV1_pHHerceptina CM5001:1_UV1_Cond Herceptina CM5001:1_UV1_Fracciones Herceptina CM5001:1_Registro Herceptina®monomérica almacenamiento limpieza citrato 10 mM, NaCl 120 mM

agregados elución, citrato 10 mM, NaCl 100 mM

elución, citrato 10 mM, NaCl 80 mM

lavado carga Residuo Herceptina SP1001:1_UV1_280 nm Herceptina SP1001:1_pHHerceptina SP1001:1_Fracciones Herceptina SP1001:1_Cond Herceptina SP1001:1_Registro almacenamiento lavado con agua limpieza elución, citrato 10 mM, NaCl 120 mM

elución, citrato 10 mM, NaCl 80 mM

lavado carga equilibración