Un método para la esterilización de un medio de separación cromatográfico,

comprendiendo el método exponer el medio de separación cromatográfico a agua a una temperatura de entre 121ºC y 135ºC bajo una presión en el intervalo de 0,2 MPa a 3,5 MPa, caracterizado porque el medio de separación cromatográfico comprende ligandos proteínicos unidos a una matriz de soporte sólida

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la esterilización de diferentes materiales, especialmente materiales sensibles, y en particular medios de cromatografía que tienen ligandos de afinidad unidos a los mismos, tales como ligandos proteínicos.

Antecedentes de la invención

La fabricación de productos biofarmacéuticos, particularmente fármacos basados en moléculas bioactivas tales como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos, requiere la producción y purificación de estas moléculas en una escala industrial. En particular, la creciente demanda de anticuerpos monoclonales (MAbs) como productos biofarmacéuticos ha promovido el desarrollo de cultivos celulares con altos niveles de expresión y, como consecuencia, la demanda de procedimientos de purificación más eficaces ha aumentado. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales están revolucionando el tratamiento de muchas enfermedades, y se han convertido en uno de los principales indicadores de la dirección en que se están moviendo los tratamientos con fármacos. Las últimas estimaciones del mercado europeo de terapéutica con anticuerpos monoclonales llegan a una cifra de 11,4 billones de dólares (8,7 billones de euros) para 2011. Este aumento de la demanda ha necesitado el uso de sistemas de cromatografía avanzados, grandes, que comprenden columnas rellenas con medios de separación tales como SEPHAROSETM , MABSELECTTM, SOURCETM Y CAPTOTM (GE Healthcare).

Durante la separación cromatográfica de productos biofarmacéuticos, es de importancia crítica asegurar que el procedimiento se realiza bajo condiciones estériles y que los contaminantes potencialmente perjudiciales son retirados del sistema antes del uso. La contaminación con bacterias y otros microbios es un problema encontrado a menudo dentro de muchas aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Diversos agentes son conocidos por su capacidad de inactivar y/o destruir poblaciones microbianas, por ejemplo, hidróxido de sodio, ácido peracético, ácido fosfórico, óxido de etileno, dióxido de cloro y alcohol bencílico. Sin embargo, la desinfección de columnas y medios cromatográficos es engorrosa, particularmente la desinfección de medios proteínicos, es decir, medios cromatográficos provistos de ligandos proteínicos, tales como diversos medios de cromatografía de afinidad. Los desinfectantes y reactivos sanitarios más eficaces, tales como ácidos o álcalis fuertes, compuestos de amonio cuaternario, compuestos que contienen halógenos, agentes oxidantes y fenoles y compuestos relacionados son considerados perjudiciales para la mayoría de los medios de cromatografía, particularmente para medios de afinidad proteínicos. Además, se considera también que los métodos de esterilización, tales como irradiación gamma y tratamiento en autoclave, tienen grandes efectos perjudiciales sobre esos medios.

Además, muchos métodos sanitarios o de esterilización que implican ácidos o álcalis, compuestos de amonio cuaternario, compuestos que contienen halógenos, agentes oxidantes y fenoles y compuestos relacionados son nocivos y/o tóxicos. Por tanto, se requieren métodos para la esterilización eficaz del material sensible, tal como los medios cromatográficos.

La patente de EE.UU. 5817528 (Böhm, W. et al) describe un método para producir una columna estéril y exenta de pirógenos que contiene un material matriz al que está acoplada una proteína. Adecuadamente, la proteína acoplada a la columna es la Proteína A de Staphilococcus aureus, o la Proteína G de Streptococcus, o la proteína puede ser un anticuerpo tal como inmunoglobulina anti-LDL humano o inmunoglobulina anti-Ig humana. El método proporciona un material matricial de columna tal como una agarosa que es activada químicamente, usando CNBr/trietilamina o usando 1,1'-carbonildiimidazol. El material matricial de cromatografía es esterilizado preferiblemente por esterilización con vapor a 115ºC, antes de combinarlo con una proteína purificada, exenta de patógenos, bajo condiciones asépticas para acoplar la proteína al material matricial.

La solicitud de patente internacional WO 2006/096116 describe un método de esterilización de una columna de cromatografía que está rellena con una matriz de separación, haciendo pasar un líquido acuoso supercalentado a través del relleno.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método de esterilización para la contaminación bacteriana y/o vírica, particularmente en medios de separación cromatográficos usados en la purificación de materiales biofarmacéuticos. Los inventores han encontrado que los medios de separación cromatográficos que tienen ligandos proteínicos particulares como los definidos en la presente memoria y que están unidos a una matriz de soporte sólida son sorprendentemente resistentes a la desnaturalización por esterilización por tratamiento en autoclave.

Así, en un primer aspecto, se proporciona un método para la esterilización de un medio de separación cromatográfico, en el que el medio de separación cromatográfico comprende ligandos proteínicos unidos a una matriz de soporte sólida, comprendiendo el método exponer el medio de separación cromatográfico a agua a una temperatura de entre 121ºC y 135ºC. El medio de separación cromatográfico es expuesto a una presión en el intervalo de 0,2 MPa a 3,5 MPa.

Los ligandos proteínicos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en moléculas que se unen a anticuerpos, particularmente análogos funcionales de la Proteína A y la Proteína G. En una realización, el medio de separación cromatográfico comprende una matriz de soporte sólida que tiene ligandos proteínicos unidos a la misma, y en

5 donde el ligando proteínico es un ligando derivado de la Proteína A estabilizado con álcali.

En una realización, el medio de separación cromatográfico es expuesto a agua bajo una presión en el intervalo de 3,0-3,5 MPa, más preferiblemente bajo una presión en el intervalo de 3,4-3,5 MPa.

En una realización, el medio de separación cromatográfico es expuesto a agua durante un periodo de tiempo en el intervalo de 10 a 60 minutos. En una realización particular, el medio de separación cromatográfico que comprende una matriz de soporte sólida que tiene ligandos proteínicos unidos a la misma es esterilizado por exposición del medio a agua a una temperatura de 121ºC y 3,4 MPa durante 12 minutos.

Preferiblemente, el medio de separación cromatográfico a ser esterilizado está contenido en una columna cromatográfica o soportado en un filtro.

15 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que muestra la capacidad de unión a IgG dinámica de una muestra de referencia de MABSELECT, comparada con MABSELECT después de un tratamiento en autoclave a 121ºC, 3,44 MPa durante 12 minutos.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la capacidad de unión dinámica de una muestra de referencia de MABSELECT SURE, comparada con MABSELECT SURE después de un tratamiento en autoclave a 121ºC, 3,44 MPa durante 12 minutos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un nuevo y eficaz método para la esterilización de columnas/medios de cromatografía y filtros, particularmente un medio de separación cromatográfico que tiene ligandos proteínicos unidos 25 al mismo. En particular, la invención se refiere a un método para la inactivación bacteriana y vírica de medios de separación cromatográficos que tienen un ligando derivado de la proteína A estabilizado por álcalis unido a los mismos. El método está basado en una exposición de los medios de separación a agua a una temperatura entre aproximadamente 121ºC y aproximadamente 135ºC, más particularmente entre aproximadamente 121ºC y aproximadamente 123ºC. En una realización particularmente preferida, el medio de separación cromatográfico es expuesto a agua a una temperatura de 121ºC.

De manera general, la esterilización con calor húmedo por tratamiento en autoclave se refiere al calentamiento de un material en un autoclave (p.ej., un aparato de desplazamiento por gravedad) bajo una presión de al menos 0,2 MPa para alcanzar una temperatura de entre aproximadamente 121ºC y aproximadamente 135ºC. En el procedimiento de esterilización, los microorganismos son matados por calentamiento en presencia de humedad y presión elevada. Véase, por ejemplo, “Understanding the Operation & Validation of Autoclaves: A Practical Approach”,... [Seguir leyendo]

1. Un método para la esterilización de un medio de separación cromatográfico, comprendiendo el método exponer el medio de separación cromatográfico a agua a una temperatura de entre 121ºC y 135ºC bajo una presión en el intervalo de 0,2 MPa a 3,5 MPa, caracterizado porque el medio de separación cromatográfico comprende ligandos proteínicos unidos a una matriz de soporte sólida.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho medio de separación cromatográfico es expuesto a agua bajo una presión en el intervalo de 3,0-3,5 MPa.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho medio de separación cromatográfico es expuesto a agua bajo 10 una presión en el intervalo de 3,4-3,5 MPa.

4. El método según la reivindicación 1, en el que dicho medio de separación cromatográfico es expuesto a agua durante un periodo de tiempo en el intervalo de 10 a 60 minutos.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho medio cromatográfico es expuesto a agua bajo una presión de 3,44 MPa y a una temperatura de 121ºC.

15 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que dicho medio de separación cromatográfico a ser esterilizado está contenido en una columna de cromatografía o soportado en un filtro.

7. El método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de dichos ligandos proteínicos ha sido mutada por sustitución de al menos un residuo de asparragina por un aminoácido distinto de la glutamina, en comparación con el ligando proteínico parental.

20 8. El método según la reivindicación 1, en el que dichos ligandos proteínicos son proteínas de unión al fragmento Fc.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio de separación cromatográfico a ser esterilizado es un ligando derivado de la proteína A estabilizado con álcali unido a una matriz de soporte.