Cromatografía de complejos metálicos.

Un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución que comprende:

cargar una solución que contiene complejos metálicos en una columna, en el que los complejos metálicos se seleccionan de compuestos miméticos de superóxido dismutasa, agentes potenciadores de imagenología por IRM, miméticos de catalasa y catalizadores de descomposición de peroxinitrito,

eluir los complejos metálicos de la columna con una fase móvil, comprendiendo dicha fase móvil una sal de un anión de coordinación en un sistema de disolventes, estando la cantidad de la sal del anión de coordinación en exceso suficiente para que el anión de coordinación sature todos los sitios de unión de ligandos intercambiables en el metal de los complejos metálicos, dirigiendo la formación de una especie única durante la elución con la fase móvil, y detectar los complejos metálicos con un detector, en el que la sal comprende al menos una sal seleccionada de cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de tetrabutilamonio, tiocianato de sodio, tiocianato de potasio, tiocianato de amonio, tiocianato de litio, acetato de potasio, acetato de sodio, trifluoroacetato de amonio, acetato de litio, formiato de potasio, formiato de sodio, formiato de amonio, formiato de litio, cianato de sodio, cianato de potasio, cianato de amonio, carboxilato de potasio, carboxilato de sodio, estearato de litio, estearato de sodio, azida de sodio, azida de potasio o azida de litio.

Cromatografía de complejos metálicos 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[1] Esta invención se refiere a un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución para la detección analítica y cuantificación de complejos metálicos, que tiene utilidad en aplicaciones farmacéuticas y de diagnóstico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[2] Las enzimas superóxido dismutasa (SOD) son enzimas que catalizan la dismutación del radical libre superóxido, el producto de reducción de un electrón del oxígeno molecular. La dismutación del radical libre

superóxido implica la conversión de este producto de reducción de un electrón del oxígeno molecular en oxígeno molecular no radical. Las enzimas superóxido dismutasas son una clase de oxidorreductasas que contienen Cu/Zn, Fe o Mn en el sitio activo. Los compuestos miméticos de superóxido dismutasa (SOD) son catalizadores de bajo peso molecular que imitan la función de la enzima natural de las enzimas superóxido dismutasas. Por lo tanto, los compuestos miméticos de superóxido dismutasa también catalizan la conversión de superóxido en oxígeno y

peróxido de hidrógeno, eliminando rápidamente las especies superóxido generadas biológicamente dañinas, que se cree que contribuyen a la patología de tejidos en una serie de enfermedades y trastornos. Estas enfermedades y trastornos incluyen enfermedades de reperfusión, tales como aquellas después de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular, trastornos inflamatorios tales como la artritis, y trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Parkinson, Chem Reviews, 1999 vol 99, No. 9, 2573-2587.

[3] Los compuestos miméticos de superóxido dismutasa tienen varias ventajas frente a las propias enzimas superóxido dismutasas en cuanto a que sus propiedades químicas se pueden alterar para potenciar la estabilidad, actividad y biodistribución, mientras que todavía tienen la capacidad de dismutar el superóxido dañino. Los compuestos miméticos de superóxido dismutasa han generado un gran interés y han sido el centro de

considerables esfuerzos para desarrollarlos como un agente terapéutico para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y trastornos, incluyendo lesión por reperfusión, neuropatías postisquémicas de miocardio isquémico, inflamación, trasplante de órganos y lesión inducida por radiación. La mayoría de los miméticos de superóxido dismutasa desarrollados actualmente como agentes terapéuticos son compuestos sintéticos de bajo peso molecular miméticos de superóxido dismutasa basados en manganeso. Chem Reviews, 2576.

[4] Los compuestos miméticos de superóxido dismutasa son complejos metálicos en los que el metal se puede coordinar con ligandos axiales. Los ejemplos de dichos complejos metálicos incluyen, pero no se limitan a complejos de los metales Mn y Fe. Muchos de los complejos de los metales Mn y Fe no tienen actividad de superóxido dismutasa pero tienen propiedades que permiten su aplicación en otros usos terapéuticos y de

diagnóstico. Estos usos terapéuticos y de diagnóstico incluyen agentes de potenciación de imagenología por IRM, catalizadores de descomposición de peroxinitrito e imitadores de catalasa. Sin embargo, estos complejos metálicos, comparten similitud estructural y tienen un metal que se puede coordinar con ligandos intercambiables. Estos complejos metálicos existen en agua como una mezcla de especies en las que son posibles diferentes ligandos. Una ilustración de dicha mezcla se proporciona por M443, un complejo de Mn(ll) de un ligando macrocíclico de 15

miembros que contiene nitrógeno, mostrado en el esquema 1. Una de las formas de este complejo metálico es el complejo dicloro, que cuando se disuelve en agua, genera otra forma donde uno de los aniones cloruro se disocia inmediatamente del metal generando el complejo [Mn(CI)(aquo)]+. El problema en los sistemas de disolventes acuosos o cualquier disolvente que tenga un potencial átomo donador es que hay una variedad de potenciales ligandos disponibles para coordinarse axialmente con el ion Mn(ll) del complejo. Cuando se lleva a cabo un análisis

de una muestra que contiene un complejo metálico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) el cromatograma tiende a ser muy ancho y no resuelto debido a la presencia de diferentes especies de complejos, como se muestra en el esquema 1. Este fenómeno hace que sean bastante difíciles la identificación y cuantificación de complejos metálicos por técnicas de HPLC estándar. Por lo tanto, a la vista del papel que están desarrollando los complejos metálicos como productos terapéuticos en el tratamiento de diferentes trastornos y como agentes de

diagnóstico, existe una necesidad sustancial de un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución eficaz y viable para analizar complejos metálicos.

[5] El documento US 6.177.419 B1 (CAMPBELL y col.) describe la HPLC realizada en diferentes compuestos que son eficaces como miméticos de superóxido dismutasa (SOD), y/o catalasa (CAT), y/o peroxidasa

(POD) y que, por lo tanto, tienen propiedades antioxidantes y/o depuradoras de radicales libres, y funcionan como antioxidantes in vivo, en particular, complejos de manganeso de derivados de bipiridina y formulaciones farmacéuticas que los contienen. El documento US 6.177.419 describe además dos sistemas de disolventes diferentes adecuados para usar como la fase móvil, que contiene cada uno acetato amónico.

Esquema 1

[6] Una complicación adicional que existe es el problema de la estabilidad en ácido del complejo metálico. Al disminuir el pH, aumenta la velocidad a la que el complejo se protona y experimenta inestabilidad. Esto presenta problemas particulares para el uso de HPLC como un procedimiento de detección y cuantificación de los complejos metálicos porque la fase móvil usada para HPLC de fase inversa con frecuencia contiene mezclas de disolventes orgánicos y agua en diferentes combinaciones con ácido trifluoroacético. El ácido trlfluoroacético normalmente está 15 presente entre aproximadamente ,1 y aproximadamente ,5% en peso. La presencia de ácido trifluoroacético hace que el complejo se disocie. Esta disociación destruye el potencial de cualquier de dichos procedimientos para usarlo como prueba de pureza antes de la liberación. Además, el anión trifluoroacetato produce la formación de algo de complejo de trifluoroacetato, que podría tener un tiempo de retención diferente de los complejos de cloro, y por lo tanto, confundir la cromatografía. Por lo tanto, el fenómeno de intercambio de llgandos, acoplado con la inestabilidad 2 en ácido de los complejos metálicos, proporciona un desafío considerable para el esfuerzo para detectar y cuantificar complejos metálicos usando HPLC. Estos desafíos y necesidades se cumplen, sorprendentemente, mediante la invención descrita a continuación.

[7] La HPLC analítica es un procedimiento potente para obtener información sobre un compuesto de 25 muestra, que incluye información relacionada con la identificación, cuantificación y resolución de un compuesto. La HPLC se ha usado en particular para el análisis de compuestos mayores y para el análisis de Iones inorgánicos para los que la cromatografía líquida no es adecuada. Skoog, D.A., West, M.A., Analytical Chemistry, 1986, pág. 52. Como herramienta analítica, la HPLC tiene la ventaja de las diferencias en afinidad que un compuesto particular de interés tiene por la fase estacionaria y la fase móvil (con aplicación continua del disolvente a la columna). Los 3 compuestos que tienen interacciones más fuertes con la fase móvil que con la fase estacionarla eluirán de la columna más rápido y por lo tanto tienen un tiempo de retención menor. La fase móvil se puede alterar con el fin de manipular las interacciones del compuesto objetivo y la fase estacionarla. En la HPLC en fase normal, la fase estacionaria es polar, tal como sílice, y la fase móvil es un disolvente no polar tal como hexano o éter ¡sopropílico. En la HPLC de fase inversa, la fase estacionaria es no polar, a menudo un hidrocarburo, y la fase móvil es un disolvente 35 relativamente polar. Desde 1974, cuando los materiales de empaquetamiento de la fase estacionarla estuvieron disponibles en el comercio, el número de aplicaciones para la HPLC de fase Inversa ha aumentado, y ahora la HPLC de fase inversa es el tipo de HPLC más ampliamente usado. La popularidad de la HPLC de fase Inversa se puede atribuir a su capacidad para separar una amplia variedad de compuestos orgánicos. La cromatografía de fase inversa es especialmente útil en la separación de componentes relacionados de mezclas de reacción, y por lo tanto

es una herramienta analítica... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución que comprende:

cargar una solución que contiene complejos metálicos en una columna, en el que los complejos metálicos se seleccionan de compuestos miméticos de superóxido dismutasa, agentes potenciadores de imagenología por IRM, miméticos de catalasa y catalizadores de descomposición de peroxinitrito,

eluir los complejos metálicos de la columna con una fase móvil, comprendiendo dicha fase móvil una sal de un anión 1 de coordinación en un sistema de disolventes, estando la cantidad de la sal del anión de coordinación en exceso suficiente para que el anión de coordinación sature todos los sitios de unión de llgandos Intercambiables en el metal de los complejos metálicos, dirigiendo la formación de una especie única durante la elución con la fase móvil, y

detectar los complejos metálicos con un detector, en el que la sal comprende al menos una sal seleccionada de 15 cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de tetrabutllamonlo, tioclanato de sodio, tiocianato de potasio, tiocianato de amonio, tlocianato de litio, acetato de potasio, acetato de sodio, trifluoroacetato de amonio, acetato de litio, formiato de potasio, formlato de sodio, formlato de amonio, formlato de litio, cianato de sodio, cianato de potasio, cianato de amonio, carboxilato de potasio, carboxllato de sodio, estearato de litio, estearato de sodio, azida de sodio, azida de potasio o azida de litio.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos se seleccionan de complejos de manganeso y complejos de hierro.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos comprenden 25 diferentes complejos metálicos.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos comprenden estereoisómeros del mismo complejo metálico.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos comprenden

diastereoisómeros del mismo complejo metálico.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el enantiómeros del mismo complejo metálico.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el productos de una corriente de reacciones.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos se seleccionan 4 del grupo que consiste en complejos de Fem(salen), derivados de FeIM(1,4,7,1,13-pentaazac¡clopentadecano),

complejos de FeIM(porfirinato), complejos de Mnm(porf¡r¡nato), complejos de Mnm(salen) y complejos de Mn"(1,4,7,1,13-pentaazaciclopentadecano).

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los complejos metálicos se seleccionan 45 de un grupo que consiste en complejos de MnIM(porfir¡nato), complejos de Mnm(salen) y complejos de

Mn"(1,4,7,1,13-pentaazaciclopentadecano).

1. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los complejos metálicos comprenden complejos de Mn"(1,4,7,1,13-pentaazaciclopentadecano).

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos comprenden estereoisómeros de un complejo metálico que tiene la siguiente estructura:

que los complejos metálicos comprenden que los complejos metálicos comprenden

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos comprenden

enantiómeros seleccionados de las siguientes estructuras:

y

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los complejos metálicos tienen la

siguiente estructura:

M4484

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema de disolventes comprende una mezcla de disolventes.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el sistema de disolventes comprende al menos un disolvente seleccionado de acetonitrilo, dioxano, etano, metanol, isopropanol, tetrahidrofurano o agua.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sistema de disolventes comprende 1 una mezcla de acetonitrilo y agua.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sistema de disolventes comprende una mezcla de metanol y agua.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sal está presente en la fase móvil en

una concentración de entre ,4 M a 6 M, preferiblemente entre ,1 M y 1 M, por ejemplo, entre ,15 M y ,6 M.

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sal es cloruro de sodio y está presente en la fase móvil en una concentración de entre ,1 M y 1 M, preferiblemente entre ,3 M y ,7 M, por

ejemplo, entre ,4 M y ,6 M.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sal es cloruro de tetrabutilamonio y está presente en la fase móvil en una concentración de entre ,5 M y ,15 M, preferiblemente entre ,1 M y ,13 M, por ejemplo entre ,5 M y ,125 M.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fase móvil está a un pH de entre 6 y 8 y comprende:

(a) acetonitrilo en agua que contiene entre ,1 M y ,7 M de sal; o 3 (b) metanol en agua que contiene entre ,15 M y ,6 M de sal.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fase móvil está a un pH de entre 6, y 7,5 y comprende:

(i) acetonitrilo que contiene cloruro de sodio entre ,3 M y ,7 M; o

(¡i) acetonitrilo al 5-15% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,1 M y ,13 M; o

(i¡¡) acetonitrilo al 5-15% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,1 M y ,13 M y cloruro de litio

entre ,3 M y ,7 M.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fase móvil está a un pH de entre 6,4 y 7,2 y comprende:

(¡v) acetonitrilo al 5-1% en agua que contiene cloruro de sodio entre ,4 M y ,6 M; o

(v) acetonitrilo al 5-1% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,5 M y ,125 M; o

(vi) acetonitrilo al 5-1% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,5 M y ,125 M y cloruro de litio entre ,4 M y ,6 M.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fase móvil comprende:

(vii) metanol al 1-5% en agua que contiene tiocianato de amonio entre ,1 M y 2,5 M; o

(viii) metanol al 1-5% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,5 M y ,3 M; o 1 (ix) metanol al 1-5% en agua que contiene tiocianato de amonio entre ,2 M y ,3 M; o

(x) metanol al 1-5% en agua que contiene cloruro de tetrabutilamonio entre ,5 M y ,15 M.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la columna es una columna modificada C1, una columna modificada C3, una columna modificada C4, una columna modificada con octilo (C8), una columna

modificada con octadecilo (C18), una columna de polímero C18, una columna de fenilo o una columna de amino- ciano, preferiblemente una columna de octadecilo, una columna de fenilo o una columna de amino-ciano.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la columna comprende una columna quiral, por ejemplo una columna de tipo Pirkle o una columna de celulosa.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el detector comprende un detector de UV.