Un método para generar al menos un ligando de afinidad quelante de metal,

polidentado, método que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos un armazón definido por la fórmula general (I):

Un método para generar ligandos de afinidad quelantes de metal.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para generar ligandos de afinidad quelantes de metal, polidentados. La invención también incluye un método para generar un medio de separación que comprende tales ligandos, así como tales ligandos y tal medio.

Fundamentos

En cualquier industria química o de biotratamiento, la necesidad de separar y purificar un producto de una mezcla compleja es una etapa necesaria e importante en la línea de producción. Hoy en día, existe un amplio mercado de métodos en que la industria puede realizar estos objetivos, uno de los cuales es la cromatografía. La cromatografía es bastante adecuada para una variedad de usos en el campo de la biotecnología, puesto que puede separar mezclas complejas con gran precisión y también es adecuada para productos más delicados, tales como las proteínas, puesto que las condiciones bajo las que se realiza no son típicamente estrictas.

Un método de cromatografía, que es una técnica de separación especialmente sensible y también aplicable a la mayoría de los tipos de proteínas, es la cromatografía de afinidad a quelatos metálicos (MCAC, por sus siglas en inglés), también conocida como cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC, por sus siglas en inglés). Esta técnica se usa comúnmente en esquemas de purificación junto con otra etapa cromatográfica, tal como cromatografía de intercambio iónico (IEX, por sus siglas en inglés) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés).

Más específicamente, la IMAC utiliza matrices que comprenden un grupo capaz de formar un quelato con un ión de metal de transición, quelato que se usa a su vez como ligando en cromatografía para adsorber un compuesto de un líquido. La resistencia a la unión en la IMAC se ve afectada fundamentalmente por las especies de ión metálico, el pH de los tampones y la naturaleza del ligando usado. Como los iones metálicos se unen fuertemente a la matriz, la proteína adsorbida se puede eluir o disminuyendo el pH o por elución competitiva.

En general, la IMAC es útil para la separación de proteínas u otras moléculas que presentan una afinidad por el ión de metal de transición de la matriz. Por ejemplo, las proteínas se unirán a la matriz en presencia de restos de histidina, cisteína y triptófano, accesibles, que presentan todos afinidad por el metal quelado.

Con la llegada de las técnicas biológicas moleculares, las proteínas son ahora fácilmente preparadas de antemano o marcadas con uno o más restos histidina para aumentar su afinidad a ligandos quelados de metal y, de acuerdo con esto, la cromatografía de quelatos metálicos ha asumido más recientemente un papel más importante en la purificación de proteínas.

Se han sugerido quelatos simples como ligandos para IMAC, tales como ácido iminodiacético (IDA). El IDA, acoplado a soportes de agarosa y cargado con posterioridad con diversos metales, tales como Cu²⁺, Zn²⁺ y Ni²⁺, se ha usado para capturar proteínas y péptidos y también está disponible como resinas comerciales. Más específicamente, la patente de EE.UU. 4.551.271 (Hochuli, cedida a Hoffmann-La Roche Inc.) describe una resina de quelato metálico que comprende ligandos de IDA, en la purificación de interferón. La resina se puede definir por la siguiente fórmula:

[agarosa]-O-(CH₂)-CHOH-CH₂-N(CH₂COO^-)₂Me²⁺.

en la que Me es Ni o Cu.

Los mejores resultados con esta resina se obtienen si el interferón se ha purificado ya parcialmente. La resina puede ser preparada según la memoria descriptiva, de una manera conocida, tratando la agarosa con epiclorhidrina o epibromohidrina, haciendo reaccionar el epóxido resultante con sal disódica de ácido iminoacético y convirtiendo el producto en la sal de cobre o de cinc por lavado con una disolución de cobre (II) o cinc.

Más recientemente, la patente europea EP 87109892.7 (F. Hoffmann-La Roche AG) y su patente de EE.UU. 4.877.830, equivalente, (Döbeli et al, cedida a Hoffmann-La Roche Inc.) describen un agente quelador tetradentado conocido como ácido nitrilotriacético (NTA) para uso con metales que tienen seis sitios de coordinación. Más específicamente, las matrices se pueden describir por la fórmula general [matriz portadora] - espaciador -NH-(CH₂)_x-CH(COOH)-N(CH₂COO^-)₂Ni²⁺, en la que x = 2-4. La matriz descrita se prepara haciendo reaccionar un compuesto de aminoácido de la fórmula R-HN-(CH₂)_x-CH(NH₂)-COOH, en la que R es un grupo aminoprotector y x es 2, 3 ó 4, con ácido bromoacético en medio alcalino y con posterioridad, después de una etapa de purificación del compuesto intermedio, separando por escisión el grupo protector y haciendo reaccionar este grupo con una matriz activada. De acuerdo con esto, el método de preparación implica etapas separadas para alquilar y desproteger el aminoácido, etapas que hacen que el método exija mucho tiempo y sea, por lo tanto, costoso. Además, la química de alquilación es menos eficaz y después de la desprotección, el producto no está bien definido con respecto a productos de soporte de la neutralización y escisión. Siguiendo a esto, el material se acopla a un soporte sólido que soporta funcionalidades carboxilo por formación de un enlace amido. Sin embargo, este procedimiento puede implicar desventajas, puesto que el medio obtenido presenta el ligando quelante deseado, inmovilizado, así como algunos grupos carboxílicos no reaccionados, proporcionando así un medio heterogéneo. Además, los compuestos de aminoácido mono-N-protegidos son materiales de partida caros, que hacen el método total incluso más costoso.

Finalmente, la patente internacional WO 01/81365 (Sigma-Aldrich Co.) describe una composición de quelante metálico que, según la memoria descriptiva, es capaz de formar quelatos relativamente estables con iones metálicos y presenta una selectividad mejorada para proteínas marcadas con polihistidina. Según dicha patente internacional WO 01/81365, la unión entre el quelante y la resina es un parámetro importante para la selectividad y el ligado es un éter neutro, un tioéter, un selenoéter o una amida. Las composiciones descritas se acoplan a un portador insoluble, tal como Sepharose^TM según ejemplos dados. El medio cromatográfico se produce de dos maneras diferentes; o por una reacción en fase sólida directamente sobre el soporte sólido preactivado usado finalmente en el medio cromatográfico o por una síntesis en disolución separada del producto intermedio N,N,N',N'-tetrakis(carboximetil)-L-cistina que se acopla finalmente al soporte sólido.

La síntesis en fase sólida se lleva a cabo por adición de L-cisteína a un gel de Sepharose^TM previamente activado de epiclorhidrina, en condiciones alcalinas, durante un tiempo de reacción prolongado (18 h), seguido por lavados. Después se añade ácido bromoacético, de nuevo en condiciones alcalinas y un tiempo de reacción prolongado (72 h) y seguido de nuevo por lavados y finalmente taponando los grupos amino libres, restantes, presentes en el gel con anhídrido de ácido acético.

La síntesis en fase sólida de esta manera ofrece un control deficiente de la reacción y potenciales reacciones secundarias y proporciona de ese modo un producto menos homogéneo.

La ruta alternativa, contando con la síntesis en fase disolución de un producto intermedio, empieza con la adición de un gran exceso (40 veces) de ácido glioxílico a L-cisteína en un tampón de borato alcalino. El producto intermedio, después de manipulaciones del pH y ajuste de la conductividad de la mezcla de reacción, se purificó después con cromatografía de intercambio iónico para proporcionar N,N,N',N'-tetrakis(carboximetil)-L-cistina.

Antes del acoplamiento a un soporte sólido se tiene que reducir la N,N,N',N'-tetrakis(carboximetil)-L-cistina a N,N-bis(carboximetil)-L-cisteína usando tris(carboxietil)fosfina en condiciones alcalinas. Este material se puede usar finalmente para acoplamiento a un soporte sólido preactivado que forme el medio cromatográfico. Este método de síntesis se elabora y depende de un gran exceso de reactivos para formar el producto deseado que se purifica finalmente en condiciones cromatográficas específicas, seguido por la reducción...

1. Un método para generar al menos un ligando de afinidad quelante de metal, polidentado, método que comprende las etapas de:

2. Un método según la reivindicación 1, en el que en la fórmula (I), X₁, X₂ y X₃ son átomos de carbono.

3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la fórmula (I), X₄ es -NH₂.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la fórmula (I), m es 1 y el armazón es homocisteína tiolactona.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la derivación se proporciona por adición de dos agentes de derivación, que comprende dos funcionalidades quelantes de metal diferentes o idénticas.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que un agente de derivación es el éster etílico del ácido bromoacético.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las funcionalidades quelantes de metal están protegidas en la etapa (b) y con posterioridad, se realizan esencialmente simultáneamente la etapa (c) y la etapa (d).

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el las etapas (a) y (b) se han realizado antes de proporcionar un armazón fácilmente derivado.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto obtenido en la etapa (d) está acoplado mediante su grupo tiol a una matriz de base para producir un medio de separación.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que el grupo tiol está acoplado a grupos alilo de la matriz de base.

11. Un método según la reivindicación 9 ó 10, que incluye también una etapa de alilación de una matriz de base para proporcionar grupos reactivos.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el grupo tiol del ligando se acopla a la matriz de base mediante el grupo alilo del alil glicidil éter (AGE).

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, que comprende también una etapa de activación de los grupos reactivos de la matriz de base.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que la activación se realiza por bromación.