Una proteína de unión a inmunoglobulina capaz de unirse a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR),

donde dicha proteína comprende dos o más unidades que se repiten como se define por SEQ ID NO: 1 o 2, en la que el resto de aminoácido en posición 23 en cada unidad es una treonina.

Una proteína mutada de unión a inmunoglobulina.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de proteínas mutantes, y más específicamente a una proteína mutante que exhibe estabilidad mejorada en comparación con la molécula pariente así como a un método de producción de una proteína mutante según la invención. La invención también se refiere a una matriz de separación por afinidad, donde una proteína según la invención es usada como un ligando de afinidad.

Antecedentes

Un gran número de aplicaciones en la industria biotecnológica y farmacéutica necesitan atención para comprender la separación definitiva de contaminantes. Dichos contaminantes pueden, por ejemplo, ser moléculas no eluidas adsorbidas en la fase estacionaria o matriz en un procedimiento cromatográfico, tal como moléculas o microorganismos no deseados, que incluyen por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La separación de tales contaminantes a partir de la matriz normalmente es llevada a cabo tras una primera elusión del producto deseado con el fin de regenerar la matriz antes de su uso posterior. Tal separación normalmente implica un procedimiento conocido como limpieza en el sitio (LES), donde se usan agentes capaces de eluir contaminantes de la fase estacionaria. En el presente, el agente de limpieza y sanitario más extensamente usado es NaOH, y la concentración del mismo puede estar en el intervalo de 0,1 hasta por ejemplo 1 M, dependiendo del grado y la naturaleza de la contaminación. NaOH es conocido por ser un agente LES eficaz que logra la reducción multirregistro de contaminantes, tales como microbios, proteínas, lípidos y ácido nucleicos. Otra ventaja del NaOH es que se elimina fácilmente sin ningún otro tratamiento. Sin embargo, esta estrategia está asociada a la exposición de la matriz a pH por encima de 13. Para muchas matrices de cromatografía por afinidad que contienen ligandos de afinidad proteicos, tales como medio ambiente alcalino, es una condición muy severa y, posteriormente, da como resultado capacidades disminuidas a causa de la inestabilidad del ligando implicado en el alto pH.

Así, se ha enfocado una investigación más extensa sobre el desarrollo de ligandos proteicos manipulados que exhiben una capacidad mejorada para resistir valores de pH alcalino. Por ejemplo, Gülich et al (Susane Gülich, Martín Linhult, Per-Anke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-17: Stability towards alkaline conditions can be engineered into a protein ligand) sugirieron la manipulación de proteínas para mejorar las propiedades de estabilidad de un dominio de unión a albúmina (DUA) de Staphylococcus en medios ambientes alcalinos. Anteriormente, se mostró que la modificación estructural, tal como desaminación y escisión de la estructura peptídica, de restos de asparagina y glutamina en condiciones alcalinas es la razón principal para la pérdida de actividad en el tratamiento en soluciones alcalinas, y que la asparagina es el más sensible de los dos (Geiger, T., y S. Clarke. 1987. Deamination, Isomerization, and Racemization al Asparaginyl and Aspartyl Residues in Peptides. J. Biol. Chem. 262:785-794). También se conoce que el ritmo de desaminación es altamente específico y dependiente de la conformación (Kosky, A.A., U.O. Razzaq, M.J. Treuheit, y D.N. Brems. 1999. The effect of alpha-helix on the stability of Asn residues: deamination rates in peptides of varing helicity. Protein Sci. 8:2519-2523: Kosiakoff, A.A. 1988. Tertiary structure is a principal determinant to protein deamidation. Science. 240:191-194; y Lura, R., y V. Schirch. 1988. Role of peptide conformation in the rate and mechanism of deamidation of asparaginyl residues. Biochemistry. 27:7671-7677), y los semi-tiempos de desaminación más cortos han sido asociados con las secuencias -asparagina-glicina- y -asparagina-serina. Por consiguiente, Gülich et al. crearon un mutante de DUA, donde los cuatro restos de asparagina del DUA natural han sido sustituidos por leucina (un resto), asparatato (dos restos) y lisina (un resto). Además, Gülich et al. describen que su mutante exhibe un comportamiento de unión a proteína diana similar al de la proteína natural, y que las columnas de afinidad que contienen el ligando manipulado muestran capacidades de unión superiores tras exposición repetida a condiciones alcalinas que las columnas preparadas usando el ligando pariente no manipulado. Así, se concluyó en la presente memoria que los cuatro restos de asparagina pueden ser sustituidos sin ningún efecto significativo sobre la estructura y la función.

Así, los estudios llevados a cabo por Gülich et al se llevaron a cabo sobre el dominio de unión a albúmina de Streptococcus. Sin embargo, la cromatografía por afinidad también se usa para la purificación de otras moléculas, tales como inmunoglobulinas, por ejemplo para aplicaciones farmacéuticas. Una clase particularmente interesante de reactivos de afinidad son las proteínas capaces de unirse de forma específica a partes invariables de una molécula de anticuerpo, tal interacción siendo independiente de la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Tales reactivos pueden ser ampliamente usados para la recuperación por cromatografía por afinidad de inmunoglobulinas de diferentes muestras tales como, pero no limitadas a, preparaciones de suero o plasma o cultivos celulares derivados de conjuntos de alimentación. Un ejemplo de tal proteína es la proteína A de Staphylococcus, que contiene dominios capaces de unirse a las porciones Fc y Fab de inmunoglobulinas IgG de diferentes especies.

Los reactivos basados en la proteína A de Staphylococcus (SpA), debido a su alta afinidad y selectividad, han encontrado un amplio uso en el campo de la biotecnología, por ejemplo, en cromatografía por afinidad para capturar y purificar anticuerpos así como para su detección. En el presente, un medio de afinidad basado en SpA probablemente es el medio de afinidad más ampliamente usado para aislar anticuerpos monoclonales y sus fragmentos a partir de diferentes muestras, incluyendo conjuntos de alimentación de cultivos celulares. Por consiguiente, están disponibles comercialmente varias matrices que comprenden ligandos de proteína A, por ejemplo, en forma de proteína A nativa (por ejemplo Proteína A Sepharose^TM, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y también comprendidas por proteína A recombinante (por ejemplo, rProteína A Sepharose^TM, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Más específicamente, la manipulación genética llevada a cabo en dicha proteína A recombinante comercial es realizada para facilitar la unión de la misma al soporte.

Por consiguiente, existe la necesidad en este campo de obtener ligandos de proteínas capaces de unir inmunoglobulinas, especialmente vía los fragmentos Fc de las mismas, que también son tolerantes a uno o más procedimientos de limpieza usando agentes alcalinos.

Compendio de la presente invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un ligando proteico mutado de unión a inmunoglobulina que exhibe una estabilidad mejorada a valores de pH aumentados, y por consiguiente, una tolerancia mejorada a la limpieza bajo condiciones alcalinas, en comparación a la molécula pariente.

Otro objeto de la invención es proporcionar tal ligando proteico, que se une específicamente al fragmento Fc de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM.

Todavía otro objeto de la invención es proporcionar un ligando proteico como se describe más arriba, que también exhibe una afinidad que se conserva durante un periodo de tiempo más largo en condiciones alcalinas que aquella molécula pariente.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una matriz de separación por afinidad, que comprende ligandos proteicos mutantes capaces de unir inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente vía sus fragmentos Fc, cuyos ligandos exhiben una tolerancia mejorada a la limpieza bajo condiciones alcalinas, en comparación con el ligando de la molécula pariente.

Uno o más de los objetos arriba definidos pueden lograrse como se describe en las reivindicaciones posteriores.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra alineamientos de aminoácidos de los cinco dominios homólogos (E, D, A, B y C) de SpA.

La Figura 2 (a) y (b) ilustra los resultados obtenidos tras tratamiento alcalino (limpieza en el lugar) de proteínas... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de unión a inmunoglobulina capaz de unirse a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), donde dicha proteína comprende dos o más unidades que se repiten como se define por SEQ ID NO: 1 o 2, en la que el resto de aminoácido en posición 23 en cada unidad es una treonina.

2. Una proteína según la reivindicación 1, que es una proteína de unión al fragmento Fc.

3. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las unidades están unidas por elementos comprendidos por hasta aproximadamente 15 aminoácidos.

4. Una proteína según la reivindicación 3, donde el elemento de unión comprende la secuencia VDAFKD.

5. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende una o más unidades que se repiten que comprenden los dominios E, D, A, B y C de la proteína A de Staphylococcus.

6. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un tetrámero.

7. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos una unidad comprende al menos el 80% de la secuencia definida por SEQ ID NO: 4.

8. Una proteína según la reivindicación 7, que es un tetrámero donde al menos una unidad comprende la secuencia definida por SEQ ID NO: 4.

9. Una proteína según la reivindicación 7 u 8, que es un tetrámero donde el elemento de unión comprende la secuencia VDAKFD.

10. Un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un sistema de expresión, que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Una matriz para cromatografía por afinidad, donde una pluralidad de ligandos que comprenden proteínas de unión a inmunoglobulinas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 han sido acopladas a un soporte sólido.

13. Una matriz según la reivindicación 12, donde los ligandos comprenden uno o más tetrámeros.

14. Una matriz según la reivindicación 12 o 13, donde los ligandos han sido acoplados al soporte por enlace tioéter.

15. Una matriz según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el soporte es un material de polisacárido.

16. Una matriz según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, que proporciona unión selectiva de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA e IgM, preferiblemente IgG.

17. Uso de una matriz según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16 en el aislamiento cromatográfico de una inmunoglobulina, cuyo uso comprende las etapas de adsorber la inmunoglobulina a la matriz; eluir dicha inmunoglobulina; limpiar la matriz con álcali; adsorber una inmunoglobulina a la matriz lavada, y eluir la inmunoglobulina.

18. Uso según la reivindicación 17, donde la limpieza es llevada a cabo con NaOH a una concentración de hasta aproximadamente 1 M, tal como aproximadamente 0,5 M.

19. Un proceso de cromatografía, donde al menos un compuesto diana es separado de un líquido por adsorción a una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o a una matriz según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16.

20. Un proceso según la reivindicación 19, donde el compuesto diana es una inmunoglobulina.