Polipéptido de fusión adecuado como citotoxina.

Polipéptido de fusión que comprende (a) un sitio de unión para la tropomiosina que comprende los aminoácidos 235-379 de la proteína NS1 de parvovirus y (b1) caseína cinasa II (CKIIα

) o el dominio catalítico de la misma, o (b2) un fragmento de CKIIß que comprende un sitio de unión para CKIIα.

Polipéptido de fusión adecuado como citotoxina.

La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden (a) un sitio de unión para la tropomiosina que comprende los aminoácidos 235-379 de la proteína NS1 de parvovirus y (b1) caseína cinasa II (CKIIe) o el dominio catalítico de la misma, o (b2) un fragmento de CKII1 que comprende un sitio de unión para CKIIe, y secuencias de ácido nucleico que codifican para dichos polipéptidos de fusión. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos polipéptidos de fusión para la preparación de una composición farmacéutica para, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades asociadas con la presencia de una población celular aberrante, preferiblemente cáncer o SIDA.

Por muchos motivos es deseable generar y usar toxinas que preferentemente destruyan las células transformadas de manera neoplásica. En el pasado esto se ha logrado con compuestos químicos (citotoxinas, citostáticos) , que con más o menos especificidad permitieron un tratamiento satisfactorio del cáncer después de la cirugía. Además de la selectividad, un problema principal de tales compuestos consiste en los efectos secundarios y también en la falta de direccionamiento competente de la sustancia, que lleva al requerimiento de dosis relativamente altas. Se cree que una forma de sortear este problema viene dada por el uso de genética dirigida usando virus recombinantes para llevar elementos genéticos a los tumores conduciendo a una expresión de la toxina en el sitio. Se ha demostrado que los parvovirus autónomos tales como KRV, MVM o H-1 se propagan preferentemente dentro y para destruir células transformadas de manera neoplásica. Además, consisten en una clase de virus que, a pesar de causar viremia en su huésped infectado, producen principalmente una infección no patogénica. Por esos motivos, se cree que los parvovirus autónomos son excelentes herramientas para la terapia génica del cáncer. Intereses particulares se centran en vectores recombinantes que mantienen su oncotropismo natural, así como su potencial oncolítico y oncosupresor. Sin embargo, hasta ahora, poco se sabe sobre la naturaleza del potencial oncosupresor de los parvovirus (que es independiente del replicón parvoviral) y, por consiguiente, el uso terapéutico de dichos virus, por ejemplo, incorporados en sistemas heterólogos como adenovirus recombinantes o virus del sarampión, para terapia génica dirigida, por ejemplo la terapia contra el cáncer todavía está en sus inicios.

El documento EP 1 275 658 A1 se refiere a composiciones que comprenden una variante de VP1 de parvovirus y una proteína NS I de parvovirus para la inducción de citólisis.

El documento EP 1 077 260 A1 muestra anticuerpos contra NS1.

Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios basados en parvovirus para terapia génica, en particular para terapia contra el cáncer dirigida, que superen las desventajas de los métodos terapéuticos de la técnica anterior, por ejemplo, con respecto a efectos secundarios y falta de especificidad.

La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Los experimentos que dan como resultado la presente invención se basaron en observaciones de que el principal componente implicado en la destrucción celular, y por tanto la actividad oncolítica de parvovirus autónomos, consiste en NS1, la principal proteína no estructural, que desempeña un papel importante durante la replicación de partículas virales de la progenie. La caracterización de NS1 reveló una proteína multifuncional dotada de una variedad de funciones enzimáticas y reguladoras, que tienen que actuar de manera coordinada durante una infección productiva. Particularmente, se mostró que las funciones citotóxicas de NS1 eran dependientes de la integridad de los sitios de fosforilación (PKC) , llevando a la disección (al menos en parte) de las funciones replicativas de NS1 de sus actividades citotóxicas por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Para diseñar toxinas nuevas eventualmente más eficaces y específicas es importante entender los mecanismos de destrucción selectiva inducida por NS1 y en consecuencia eliminar funciones indeseadas y eventualmente incluso contraproducentes del polipéptido.

Con estas perspectivas se diseñaron nuevos polipéptidos / compuestos (deseablemente pequeños) con características diferenciadas basándose en la destrucción celular inducida por NS1, independiente de las funciones replicativas del polipéptido. Analizando las funciones citotóxicas de NS1 se demostró que regiones bastante diferenciadas del polipéptido son más importantes para la destrucción celular que sus actividades enzimáticas. Estos descubrimientos llevaron a la conclusión de que regiones diferenciadas de NS1 podían interaccionar específicamente con proteínas asociadas celulares y que la (s) actividad (es) citotóxica (s) consiste (n) en un complejo multiproteico ensamblado mediante NS1 en vez de una actividad catalítica de la proteína viral sola. Además, la mutagénesis en sitios de fosforilación PKC consenso conservados llevó a la destrucción de las actividades tóxicas de NS1, lo que sugiere una fuerte regulación de esta propiedad de NS1. Los estudios iniciales que llevan a la presente invención implicaron que tal regulación de la toxicidad de NS1 no sólo ocurre de manera coordinada sincronizada mediante fosforilación a través de distintas cinasas, sino también por compartimentalización de la célula, llevando a la conclusión de que el direccionamiento de NS1 al sitio de acción es una característica adicional de regulación.

Pudieron identificarse dos proteínas asociadas que se unen con alta afinidad a NS1 de tipo natural, sin embargo, carecen de afinidad para mutantes dirigidos al sitio de NS1 deficientes para la citotoxicidad. Por tanto, pudieron identificarse la unión de caseína cinasa IIe a la región alrededor de S473 y la unión de tropomiosina a la región alrededor de T363 de NS1. Análisis de impacto de NS1 en la célula huésped han presentado múltiples efectos, que podían llevar a la citostasis y/o a la inducción de citólisis. Algunos de ellos podrían ser sólo efectos secundarios de funciones replicativas de NS1, mientras que otros se inducen específicamente para liberar partículas virales de progenie de células infectadas. Las últimas actividades de NS1 son de particular interés para diseñar nuevos fármacos. Además de la parada del ciclo celular en fase S de células infectadas, la expresión de la proteína NS1 sola lleva a drásticos cambios morfológicos (contracción celular) , manifestados por una desorganización del citoesqueleto en células susceptibles. Análisis más detallados han demostrado que después de la infección por MVM de células A9 se ven afectados predominantemente filamentos de vimentina y tropomiosina, mientras que los microtúbulos permanecen sin verse afectados, lo que indica un impacto selectivo de la proteína NS1 hacia la célula huésped. En parte, la dinámica de estos filamentos de citoesqueleto parece estar bajo la regulación de PKC, que a su vez se ven desregulados tras la infección por MVM. Sin embargo, lo que es más importante, los filamentos de tropomiosina se ven afectados directamente por la formación de complejo de NS1 con CKIIe. Estas investigaciones llevaron a asumir que la tropomiosina, un componente del citoesqueleto que está sujeto a alteraciones tras la transformación, se selecciona como diana por NS1/CKIIe llevando a la muerte celular y eventualmente la citólisis. En particular, aunque la tropomiosina 2 (TM2) es la diana genuina de CKIIe1 (la holoenzima existente en células eucariotas) , la interacción de alta afinidad con NS1 que forma el complejo NS1/CKIIe ya no reconoce TM2 como sustrato pero puede fosforilar TM5, una isoforma de tropomiosina alternativa. En consecuencia la estructura filamentosa de tropomiosina se altera en presencia de la proteína viral.

Como se mencionó anteriormente, en lugar de sus propias funciones enzimáticas, la citólisis inducida por NS1 es más bien dependiente de la formación de un complejo (multi) proteico ensamblado por la proteína viral a través de interacciones proteína/proteína con polipéptidos celulares (pre-existentes) . Tales complejos proteicos podrían tener actividades catalíticas completamente diferentes a las de la proteína NS1 purificada como se caracterizaron en exhaustivas investigaciones. Particularmente la interacción de NS1 con la subunidad catalítica de caseína cinasa II propone una variedad de nuevas opciones. De hecho, pudo demostrarse... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido de fusión que comprende (a) un sitio de unión para la tropomiosina que comprende los aminoácido.

23. 379 de la proteína NS1 de parvovirus y (b1) caseína cinasa II (CKIIe) o el dominio catalítico de la misma, o (b2) un fragmento de CKIIº que comprende un sitio de unión para CKIIe.

2. Polipéptido de fusión según la reivindicación 1, en el que ambas partes (a) y (b) del polipéptido de fusión están unidas por un ligador peptídico.

3. Polipéptido de fusión según la reivindicación 2, en el que dicho ligador peptídico es EGFP.

4. Polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sitio de unión (b2) para la caseína cinasa II (CKIIe) comprende la secuencia de aminoácidos DLEPDEELED.

5. Secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector recombinante que contiene la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Vector recombinante según la reivindicación 6, en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a elementos reguladores que permiten la transcripción y síntesis de un ARN traducible en células huésped procariotas y/o eucariotas.

8. Célula huésped recombinante que contiene el vector recombinante según la reivindicación 6 ó 7.

9. Célula huésped recombinante según la reivindicación 8, que es una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula de insecto o una célula de levadura.

10. Animal transgénico no humano que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5

o el vector recombinante según la reivindicación 6 ó 7, siendo dicho animal un ratón, rata, hámster, perro, conejo, cerdo, C. elegans o pez transgénico.

11. Composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5 o el vector recombinante según la reivindicación 6 ó 7.

12. Uso del polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5 o el vector recombinante según la reivindicación 6 ó 7 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad asociada con la presencia de una población celular aberrante.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que dicha enfermedad es cáncer o SIDA.