Línea de células de doble transfección útil para la identificación de inhibidores del transporte.

Una línea de células de mamífero doblemente transfectada, transfectada de manera estable con (a) unasecuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos enlazada operativamente conun promotor y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos oconjugados aniónicos enlazada operativamente con un promotor,

en donde el transportador de absorción paraaniones orgánicos se expresa en la membrana basolateral y la bomba de exportación se expresa en la membranaapical.

Línea de células de doble transfección útil para la identificación de inhibidores del transporte La presente invención se refiere a una línea de células de doble transfección que contiene (a) una secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos, preferiblemente OATP8, enlazada operativamente con un promotor y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos, preferiblemente la proteína 2 de resistencia a multifármacos (MRP2) , enlazada operativamente con un promotor. La presente invención se refiere también a diversos usos de dicha línea de células, preferiblemente para la identificación de inhibidores del transporte, v.g. fármacos candidato.

El transporte vectorial es una función importante de todas las células polarizadas que contribuyen a la destoxificación y a la prevención de la entrada de toxinas en los órganos. Esto se ilustra por los epitelios de los tubos renales proximales, por las células de la barrera hematoencefálica, por los epitelios intestinales, y, finalmente pero no por ello menos importante, por los hepatocitos. Una de las funciones hepatocelulares principales es la eliminación de sustancias endógenas y exógenas de la circulación sanguínea y su secreción en la bilis. Dos procesos de transporte juegan un papel decisivo en este transporte vectorial por los hepatocitos: la absorción sinusoidal

(basolateral) de la sangre y la secreción canalicular (apical) en la bilis. En los hepatocitos humanos, la absorción independiente del sodio de aniones orgánicos anfifílicos está mediada por al menos tres proteínas de transporte, a saber por los transportadores de aniones orgánicos humanos OATP2 (conocido también como OATP-C o LST1, símbolo SLC21A6) (Abe et al. 1999) ; Hsiang et al., 1999; König et al. 2000a; Cui et al. 2001) , OATP8 humano (SLC21A8) (König et al. 2000b; Cui et al. 2001) , y OATP-B humano (SLC21A9) (Kullak-Ublick et al. 2001) . Los tres transportadores pertenecen al subgrupo 21A de la superfamilia de portadores de solutos (SLC) . En tanto que OATP-B se expresa también en cierto número de otros tejidos, OATP2 y OATP8 se expresan exclusivamente en los hepatocitos humanos. El espectro de sustratos de OATPs incluye sales biliares, conjugados de hormonas esteroidales, hormonas tiroideas, y muchos otros aniones orgánicos anfifílicos (Abe et al. 1999; König et al. 2000a, b; Cui et al. 2001; Kullak-Ublick et al. 2000, 2001) . Al contrario de estos transportadores de absorción basolateral

que se cree son de tipo intercambiador (Li et al. 1998) , los transportadores de exportación apicales identificados en los hepatocitos humanos hasta ahora son miembros de la superfamilia de casetes de fijación de ATP (ABC) (Keppler y Arias 1997; Jansen 2000) . La exportación de aniones orgánicos está mediada predominantemente por la bomba de exportación de sales biliares BSEP (ABCB11) perteneciente al subgrupo MDR (ABCB) de la superfamilia ABC (Strautnieks et al. 1998; Gerloff et al. 1998; Wang et al. 2001) y por la proteína 2 de resistencia a multifármacos (MRP2, ABCC2) perteneciente al subgrupo MRP (ABCC) de la superfamilia ABC (Büchler et al. 1996; Suzuki y Sugiyama 1998; König et al. 1999; Borst et al. 2000) . Mientras que los sustratos principales de BSEP son sales biliares como colil-taurina y colato (Gerloff et al. 1998) , los aniones orgánicos transportados por MRP2 son principalmente conjugados de sustancias lipófilas con glutatión, glucuronato, o sulfato (Evers et al. 1998; Cui et al. 1999, König et al. 1999) .

El transporte transhepático de aniones orgánicos anfifílicos ha sido estudiado frecuentemente por el uso de compuestos modelo como sulfobromoftaleína (BSP) y verde de indocianina (ICG) (Scharschmidt et al. 1975) . La caracterización funcional de los tres OATPs humanos identificados en la membrana basolateral de los hepatocitos demostró que los tres son capaces de mediar la absorción de BSP, con la afinidad máxima para OATP2 (Km = 140 nM) y afinidad mínima (Km = 3, 4 μM) para OATP8 (König et al. 2000b; Kullak-Ublick et al. 2001; Cui et al. 2001) . En los hepatocitos, BSP se conjuga predominantemente con glutatión para producir el conjugado BSP--glutatión S (BSP-SG) (Whelan et al. 1970; Snel et al. 1995) . Estudios con ratas mutantes deficientes en transporte (Jansen et al. 1987) que carecen de la bomba de exportación canalicular Mrp2 (Paulusma et al. 1996; Büchler et al. 1996; Ito et al. 1997) sugerían que esta bomba de exportación media la secreción de BSP-SG en la bilis. Sin embargo, no se estableció que BSP propiamente dicha sea un sustrato para MRP2 humana. Hasta ahora, las proteínas de 45 transporte como OATPs y MRPs se estudiaron en la mayoría de los casos por el uso de células transfectadas de mamífero o por el uso de sistemas de oocitos de Xenopus que expresaban únicamente una proteína de transporte exógena recombinante (Madon et al. 1997; Ito et al. 1998; Evers et al. 1998; Cui et al. 1999, 2001; Abe et al. 1999; Hsiang et al. 1999; König et al. 2000a, b; Kullak-Ublick et al. 2001) .

Cuando se desarrollan o se diseñan nuevos productos farmacéuticos, una de las cuestiones críticas es conocer si 50 los compuestos candidato tienen efectos secundarios indeseables como la interferencia con el transporte de sustancias que son producidas o existen naturalmente en el cuerpo, v.g. la interferencia con el transporte hepático o renal de aniones orgánicos, como se ilustra por la interferencia de rifampicina, rifamicina SV, o CDNB con el transporte transcelular de BSP. Para ahorro de costes, es deseable detectar tales efectos secundarios de los fármacos candidato en una etapa de desarrollo temprana. Hasta ahora, para el estudio de los efectos secundarios 55 potenciales de los fármacos candidato se utilizaban animales o cultivos de células. Sin embargo, estos métodos presentan una diversidad de desventajas, v.g. consumen mucho tiempo y costes, no permiten el cribado de alta capacidad de fármacos candidato, etc.

Por esta razón, es el objeto de la presente invención proporcionar un medio para el análisis eficiente de la interferencia de un fármaco candidato con el transporte de sustancias que son producidas o existen naturalmente en 60 el cuerpo, en particular la interferencia con el transporte hepático o renal de aniones orgánicos que resuelva las desventajas de los sistemas utilizados actualmente. 2

De acuerdo con la invención, esto se consigue por las materias objeto definidas en las reivindicaciones. Se estableció un sistema de células con transportadores de la absorción y exportación humana definidos, es decir una línea de células MDCK de doble transfección que exprese permanentemente un transportador recombinante de la absorción para aniones orgánicos en la membrana basolateral y una bomba de exportación dependiente de ATP 5 para conjugados aniónicos en la membrana apical. La absorción basolateral se mediaba por el transportador de aniones orgánicos humano OATP8 (símbolo SLC21A8) y la exportación apical subsiguiente por la proteína 2 de resistencia a multifármacos (MRP2; símbolo ABCC2) . En condiciones fisiológicas, ambas proteínas de transporte se expresan fuertemente en los hepatocitos y contribuyen a la eliminación hepatobiliar de aniones orgánicos. La expresión y localización de OATP8 y MRP2 en células MDCK que crecen en insertos de membranas Transwell se 10 demostró por inmunotransferencia y microscopía confocal de barrido láser. La sulfobromoftaleína (BSP) marcada con 3H era un sustrato para ambas proteínas de transporte y era transferida desde el compartimiento basolateral al apical a una tasa al menos 6 veces más rápida por las células MDCK-MRP2/OATP8 de doble transfección que por las células MDCK-OATP8 o MDCK-MRP2 de transfección simple. El transporte vectorial a una tasa mucho mayor por las células de doble transfección que por las de transfección simple se observó también para los sustratos marcados con 3H leucotrieno C4, 17b-glucuronosil-estradiol, y sulfato de deshidroepiandrosterona, para el sustrato aniónico fluorescente fluo-3, y para el antibiótico rifampicina. Estudios de inhibición indicaron que la formación intracelular de S- (2, 4-dinitrofenil) -glutatión a partir de 2, 4-clorodinitrobenceno inhibe selectivamente el transporte transcelular de [3H]BSP en el sitio de exportación mediada por MRP2.

La identificación de los nuevos sustratos para MRP2 y OATP8 demuestra que la línea de células de doble transfección es útil para la caracterización de estos transportadores. En comparación con las células MDCK transfectadas por separado con OATP8 o MRP2, los transfectantes dobles presentan varias ventajas. Hasta ahora había sido difícil estudiar la función de MRP2... [Seguir leyendo]

1. Una línea de células de mamífero doblemente transfectada, transfectada de manera estable con (a) una secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos enlazada operativamente con un promotor y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos enlazada operativamente con un promotor, en donde el transportador de absorción para aniones orgánicos se expresa en la membrana basolateral y la bomba de exportación se expresa en la membrana apical.

2. La línea de células de la reivindicación 1, en la cual la línea de células se obtiene por transfección estable con (a) una secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos enlazada operativamente con un promotor presente en un vector o virus recombinante y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos enlazada operativamente con un promotor presente en un vector o virus recombinante.

3. La línea de células de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que es una línea de células caninas o humanas y las secuencias de DNA de (a) y/o (b) son humanas.

4. La línea de células de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es una línea de células de riñón.

5. La línea de células de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la cual el transportador de absorción para aniones orgánicos en un miembro del subgrupo 21A o 22A de la superfamilia de portadores de solutos (SLC) .

6. La línea de células de la reivindicación 5, en la cual el transportador de absorción para aniones orgánicos es OAT1 (SNC22A6) , OATP2 (SLC21A6) , OATP8 (SLC21A8) , u OATP-B (SLC21A9) .

7. La línea de células de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual la bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos es un miembro del subgrupo MDR (ABCB) o el subgrupo MRP (ABCC) de la superfamilia ABC.

8. La línea de células de la reivindicación 7, en la cual la bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos es la bomba de exportación de sales biliares BSEP (ABCB11) o la proteína 2 de resistencia a 25 multifármacos (MRP2; ABCC2) .

9. La línea de células de la reivindicación 1, en la cual la secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos y/o la secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos están enlazadas operativamente con un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (pCMV) .

10. Un proceso para la producción de una línea de células doblemente transfectada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que está transfectada de manera estable con (a) una secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos enlazado operativamente con un promotor y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos enlazada operativamente con un promotor, que comprende los pasos de:

- transfectar las células con ambas secuencias de DNA de (a) y (b) ; y

-seleccionar los transfectantes que expresan dicho transportador de absorción para aniones orgánicos y dicha bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos.

11. El uso de una línea de células polarizadas de doble transfección para analizar la interferencia de un fármaco candidato con el transporte de sustancias que se producen o existen naturalmente en el cuerpo, en el cual

la línea de células está transfectada de manera estable con (a) una secuencia de DNA que codifica un transportador de absorción para aniones orgánicos enlazado operativamente con un promotor y (b) una secuencia de DNA que codifica una bomba de exportación para aniones orgánicos o conjugados aniónicos enlazada operativamente con un promotor.

12. El uso de la reivindicación 11, en el cual el transporte de las sustancias es transporte hepático o renal de 45 aniones orgánicos.

13. El uso de una línea de células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el uso de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12 para la identificación de un sustrato de transporte o un inhibidor de transporte.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual el inhibidor de transporte es un fármaco candidato.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el cual la identificación de un sustrato de transporte o un 50 inhibidor del transporte se lleva a cabo como cribado de alta capacidad.

Fig.9