Nuevos anticuerpos Anti-IL 13 y usos de los mismos.

Un anticuerpo anti-IL-13 de ser humano antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que seune específicamente a IL-13 humana,

en el que dicho anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpoproducido por hibridoma 228B/C que se designa con el número de depósito de ATCC PTA-5657, a IL-13.

Nuevos anticuerpos Anti-IL13 y usos de los mismos Antecedentes de la invención La interleucina (IL) -13 es una citocina de la subclase 2 de células T coadyuvantes (Th2) pleiotrópica. Al igual que IL4, IL13 pertenece a la familia de citocinas de tipo I que comparten la estructura terciaria definida por un núcleo de haz hidrófobo 4a-helicoidal. IL13 tiene aproximadamente una homología de secuencia de aminoácidos del 30 % con IL4 y comparte muchas de las propiedades de IL4 (Wynn, Ann. Rev. Immunol., 21: 425 (2003) ) . La similitud funcional de IL4 e IL13 se atribuye al hecho de que IL13 puede unir cadena alfa del receptor de IL4 (IL4R-α) de forma subsiguiente a su unión a cadena-1 alfa de receptor de IL13 (IL13Rαl) (Hershey, J. Allergy Clin. Immunol., 111: 677 (2003) ) . IL4Rα se activa por IL4 e IL13 dando como resultado fosforilación de STAT6 dependiente de Jakl. Ambas IL4 e IL13 promueven la proliferación de células B e inducen cambios de clase a IgG4 e IgE en combinación con coestimulación CD40/CD40L (Punnonen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 3730 (1993) , Oettgen y cols., J. Allergy Clin. Immunol., 107: 429 (2001) ) . Se mostró que un anticuerpo anti-IL-13 de ser humano (clon JES 10-5A2) neutraliza el 50 % de la bioactividad de IL-13 a 50 ng/ml (Campbell y cols., FASEB Journal, 18: 329-331 (2003) ) .

Sin embargo, a diferencia de IL4, IL13 no está implicada en la diferenciación de células T indiferenciadas en células Th2 (Zurawski y cols., Immunol. Today, 15: 19 (1994) ) . IL13 regula al alza FcsRI y así ayuda en la preparación con IgE de los mastocitos (de Vries, Allergy Clin. Immunol. 102: 165 (1998) . En los monocitos/macrófagos, IL13 regula al alza la expresión de de CD23 y de los antígenos de clase I y de clase II de MHC, regula a la baja la expresión de Fcγ y de CD14 e inhibe la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (de Waal Malefyt y cols., J. Immunol., 151: 6370 (1993) , Chomarat y cols., Int. Rev. Immunol., 17: 1 (1998) ) . IL13, pero no IL4, promueve la supervivencia, la activación y la atracción de eosinófilos (Horie y cols., Intern. Med., 36: 179 (1997) , Luttmann y cols., J. Immunol. 157: 1678 (1996) , Pope y cols., J. Allergy Clin. Immunol., 108: 594 (2001) . IL13 también manifiesta importantes funciones de células no hepatopoyéticas, tales como células de músculo liso, células epiteliales, células endoteliales y células de fibroblastos. IL13 potencia proliferación y contracciones inducidas colinérgicamente de músculos lisos (Wills-Karp, J. Allergy Clin. Immunol., 107: 9 (2001) ) . En las células epiteliales IL13 es un potente inductor de la producción de quimiocinas (Li y cols., J. Immunol., 162: 2477 (1999) , altera diferenciación mucociliar (Laoukili y cols., J. Clin. Invest., 108: 1.817 (2001) , disminuye la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales ciliadas (Laoukili y cols., J. Clin. Invest., 108: 1.817 (2001) y da como resultado la metaplasia de células caliciformes (Zhu y cols., J. Clin. Invest., 103: 779 (1999) , Grunig y cols., Science, 282: 2261 (1998) ) . En las células endoteliales IL13 es un potente inductor de la molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) que es importante para la atracción de eosinófilos (Bochner y cols., J. Immunol., 154: 799 (1995) ) . En fibroblastos dérmicos humanos IL13 induce síntesis de colágeno de tipo 1 en fibroblastos dérmicos humanos (Roux y cols., J. Invest. Dermatol., 103: 444 (1994) ) .

Aunque IL13 y IL4 comparten ciertas similitudes funcionales, los estudios en modelos animales de la enfermedad y en ratones con genes inactivados demostraron que IL13 posee funciones efectoras únicas distintas de IL4 y proporciona evidencia de peso de que IL13, independientemente de otras citocinas de Th2, es necesaria y suficiente para inducir todas las características de asma alérgica (Wills-Kaip y cols. Science 282: 2258 (1998) , Walter y cols. J. Immunol. 167: 4668 (2001) ) . IL13 puede desempeñar un papel más significativo que otras citocinas de Th2 en funciones efectoras asociadas con los síntomas de asma (Corr y , Curr. Opin. Immunol., 11: 610 (1999) ) . Esta afirmación está apoyada en la enfermedad humana por una fuerte asociación entre niveles de IL13 y polimorfismos genéticos en el gen de IL13 y la enfermedad correlaciona (Wiiis-Karp. y cols. Respir. Res. 1:19 (2000) ; Vercelli y cols., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 2: 389 (2002) ; He y cols., Genes Immunol., 4: 385 (2003) , Arima y cols., J. Allergy Clin. Immunol., 109: 980 (2003) , Liu y cols., J. Clin. Allergy Immunol., 112: 382 (2003) ) . Los datos sugieren que IL13 induce características de la respuesta alérgica por medio de sus acciones en el epitelio mucosal y las células musculares lisas, más que por sus rutas tradicionales que implican eosinófilos y eventos mediados por IgE (Wills-Karp y cols., Sci., 282: 2258 (1998) ) .

El asma se describe como una enfermedad pulmonar crónica que implica la inflamación, la hiperresponsividad y la obstrucción de las vías respiratorias. Fisiológicamente, la hiperrresponsividad de las vías respiratorias está documentada por el flujo de aire bronquial después de broncoprovocación con metacolina o histamina. Otros desencadenantes que provocan obstrucciones de la vías respiratorias incluyen aire frío, ejercicio, infección respiratoria superior vírica, fumar cigarrillos y alérgenos respiratorios. La provocación bronquial con alérgeno induce un decrecimiento mediado por inmunoglobulinas E (IgE) de fase temprana rápido en el flujo de aire bronquial seguido en muchos pacientes por una reacción mediada de fase tardía con un decrecimiento en flujo de aire bronquial durante 4-8 horas. La respuesta temprana está causada por la liberación aguda de sustancias inflamatorias, tales como histamina, PGD2, leucotrieno, triptasa y factor de activación plaquetaria (PAF) mientras que la respuesta tardía está causada por citocinas pro-inflamatorias sintetizadas de novo (por ejemplo TNFΑ, IL4, IL13) y quimiocinas (por ejemplo, MCP-1 y MIP-1α) (Busse y cols. En: Allergy: Principles and Practice, Ed. Middlestdn, 1173 (1998) ) . En pacientes asmáticos crónicos, los síntomas pulmonares persistentes están mediados por la respuesta intensificada de células Th2. Se cree que las citocinas Th2 juegan un papel vital en la enfermedad (Larche y cols., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450 (2003) ) , en particular, IL13 e IL4 producidas por células Th2 con fenotipo NK (NKT) en las vías respiratorias según se indica en un modelo de asma en roedores (Akbari y cols., Nature Med., 9: 582 (2003) ) . La patología macroscópica de las vías respiratorias asmáticas muestra hiperinsuflación pulmonar, hipertrofia

de músculo liso, engrosamiento de lamina reticularis, edema mucosal, esfacelación de células epiteliales, disrupción de células ciliares e hipersecreción de glándulas mucosas. Microscópicamente, el asma se caracteriza por la presencia de números incrementados de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y células plasmáticas en los tejidos bronquiales, las secreciones bronquiales y el mucus. Inicialmente, hay atracción de leucocitos desde la corriente sanguínea a las vías respiratorias por linfocitos T CD4+ activados. Los linfocitos T activados también dirigen la liberación de mediadores inflamatorios a partir de eosinófilos, mastocitos y linfocitos. Además, las células Th2 producen IL4, IL5, IL9 e IL13. IL4, junto con IL13, señala el cambio desde anticuerpos IgM hasta anticuerpos IgE.

La reticulación de moléculas de IgE unidas a membranas por alérgenos causa que se degranulen los mastocitos, liberando histamina, leucotrienos y otros mediadores que perpetúan la inflamación de las vías respiratorias. IL5 activa la atracción y activación de los eosinófilos. Los mastocitos y eosinófilos activados generan también sus citocinas que ayudan a perpetuar la inflamación. Estos ciclos repetidos de inflamación en los pulmones con daño a los tejidos pulmonares seguidos por reparar pueden producir cambios estructurales a largo plazo ("remodelación") de las vías respiratorias.

El asma moderada se trata actualmente con un corticosteroide antiinflamatorio inhalado diariamente o con un inhibidor de mastocitos tal como el cromoglicato sódico o el nedocromil más un agonista beta2 inhalado según se necesite (3-4 veces por día) para aliviar los síntomas intercurrentes o el asma inducida por alérgenos o por ejercicios. El cromoglicato sódico y el nedocromil bloquean broncoespasmo e inflamación, pero usualmente son eficaces solamente para el asma que está asociada con alérgenos o ejercicio y típicamente, solamente para asmáticos juveniles. Los corticosteroides inhalados mejoran la inflamación,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-IL-13 de ser humano antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana, en el que dicho anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo producido por hibridoma 228B/C que se designa con el número de depósito de ATCC PTA-5657, a IL-13.

2. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos ESLINVSG o YCAALESLINVS.

3. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2 en el que dicho anticuerpo comprende (a) una región de cadena ligera variable (VL) que comprende una CDRL1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 99, una CDRL2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 104 y una CDRL3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 115; y (b) una región de cadena pesada variable (VH) que comprende una CDRH1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 117, una CDRH2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 123 y una CDRH3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 135.

4. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, que comprende secuencias humanizadas de un anticuerpo producido por hibridoma 228B/C-1, que se designa con el número de depósito de ATCC, PTA-5657.

5. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena de la región VL elegida a partir de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3, 142, 144 y 150 y una región de la cadena de VH elegida a partir de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 143, 145, 146, 147, 148 y 149.

6. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo comprende las regiones de unión a antígeno derivadas de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo producido por hibridoma 228B/C-1 (PTA-5657) .

7. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2 en el que dicho anticuerpo comprende una cadena de la región VL que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 142 y una región de la cadena de VH que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 143.

8. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2 que comprende:

(a) una cadena de la región VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula: FRL1CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4, en la que FRL1 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 20 a 25; CDRL1 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 99 a 103; FRL2 consiste en la SEQ ID NO: 29; CDRL2 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 104 a 114; FRL3 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 30 a 56; CDRL3 consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs: 115 a 116; y FRL4 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 57 a 59; y

(b) una cadena de la región VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula: FRH1CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4, en la que FRH1 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 60 a 66; CDRH1 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 117 a 122; FRH2 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 67 a 75; CDRH2 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 123 a 134; FRH3 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 76 a 90; CDRH3 consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs: 135 a 141; y FRH4 consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 91 a 92.

9. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG.

11. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4.

12. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo está humanizado.

13. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena individual, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un fragmento Fab.

14. El fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que es un Fab.

15. El anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 13, que es un anticuerpo multiespecífico que es un anticuerpo biespecífico.

16. Una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 228B/C-1, que se designa con el número de depósito de ATCC PTA-5657.

17. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 17.

19. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 18.

20. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para usar en el tratamiento de asma.

22. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para usar en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

23. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para usar en el tratamiento del asma bronquial, rinitis alérgica, urticaria, o la dermatitis alérgica o para usar en la prevención del asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica o anafilaxia.

24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para usar en el tratamiento del asma alérgica, asma no alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eczema, urticaria, alergias alimentarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, infección por VRS, uveitis, esclerodermia, u osteoporosis.

25. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-13 humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para usar en el tratamiento de fibrosis pulmonar idiopática o inflamatoria y enfermedad pulmonar fibrótica.

26. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, para el uso de acuerdo con las reivindicacione.

2. 25, caracterizado porque el anticuerpo antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por inhalación, inyección de gran tamaño o infusión.

27. Un procedimiento para producir un anticuerpo antagonista anti-IL-13 humana o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la etapa de expresar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por el polinucleótido de la reivindicación 17 o por el vector de la reivindicación 18 a partir de una célula huésped.

28. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende adicionalmente la etapa de purificar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo expresado a partir de la célula huésped.

29. Un anticuerpo anti-IL-13 humana antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo obtenido a partir de la línea celular de hibridoma de la reivindicación 16 o de la célula huésped de la reivindicación 19.

30. Un anticuerpo anti-IL-13 humana antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo obtenido a partir del procedimiento de la reivindicación 27 o 28.

FIGURA 13A

FIGURA 13B FIGURA 13C

FIGURA 13D FIGURA 14A

FIGURA 14B FIGURA 15 FIGURA 16

FIGURA 20