Nanopartículas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de mucosas.

La presente invención se refiere a nanopartículas poliméricas las cuales que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada de modo que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, o un plásmido o una construcción genética que lo contenga, y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas. También se refiere a una composición farmacéutica que comprenda dichas nanopartículas y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas.

Nanopartículas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de mucosas.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología, y más concretamente de la biomedicina. Específicamente, se refiere a nanopartículas que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, o un plásmido o una construcción genética que lo contenga, y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las mucosas del organismo son uno de los elementos más sensibles a afecciones tanto inflamatorias como infecciosas. Dentro de estas mucosas, uno de los elementos de mayor importancia son las mucinas. Estas mucinas son un grupo heterogéneo de glucoproteínas de elevado peso molecular y son el elemento fundamental de las secreciones mucosas del organismo. Dentro de este grupo existen descritas al menos 17 proteínas diferentes con diferentes características tanto de expresión como funcionales.

Estas mucinas son especialmente relevantes en el caso de la mucosa ocular, donde las mucinas presentan elevada importancia en la homeostasis del tejido mucoso, así como en la lubricación de los epitelios tanto corneal como conjuntival durante el parpadeo. Además, las mucinas actúan a nivel ocular como estabilizadores de la película lagrimal previniendo la desecación del epitelio y como barrera frente a la entrada tanto de agentes extraños como de patógenos.

Debido a la importancia de estas mucinas, la deficiencia en las mismas lleva aparejados diversos problemas patológicos oculares. Estos problemas afectan fundamentalmente a un conjunto de estructuras presentes en la parte anterior del ojo denominadas en su conjunto "superficie ocular" lo que es considerado una unidad funcional establecida (Stern et al, 1998. Cornea. 17:584-589) . Esta superficie ocular es un tejido mucoso similar a otras mucosas del organismo como la mucosa del tracto gastro-intestinal, la mucosa de las vías respiratorias, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal.

Ejemplos de enfermedades que cursan con alteración en la regulación de producción de mucinas son, por ejemplo, enfermedades autoinmunes que cursan con inflamación. En estos casos se puede dar lugar, en función de la enfermedad, a una superproducción o una subproducción de las mucinas características de la superficie ocular. Esta variación de los niveles de las mucinas, hacen que la homeostasis producida por las mismas no se produzca y por lo tanto dé lugar a procesos patológicos graves que pueden tener influencia en la función visual.

Una de las enfermedades de mayor incidencia, en relación con las mucinas y la superficie ocular es el denominado síndrome de ojo seco. Esta enfermedad afecta, por ejemplo, a un 10% de la población adulta (Viso et al, 2009. Ophthalmic Epidemiol. 16:15-21) alcanzando un 14, 6% en la población de más de 65 años (Schein et al, 1997. Am J Ophthalmol. 124:723-728) . Esta enfermedad está fuertemente relacionada con el envejecimiento, así como con el sexo ya que afecta mayoritariamente a mujeres. De este modo, la prevalencia de esta enfermedades puede llegar al 40% en mujeres postmenopáusicas (Schaumberg et al, 2003. Am J Ophthalmol. 136:318-326) .

Otras enfermedades importantes, que no alcanzan la incidencia del síndrome de ojo seco son las enfermedades alérgicas graves como por ejemplo la queratoconjuntivitis atópica (AKC) o la queratoconjuntivitis vernal (VKC) , las cuales pueden alcanzar una incidencia del 4, 4% y 3, 8% respectivamente, del total de pacientes de alergias oculares en Japón (Uchio et al, 2008. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 246:291-296) . En otros estudios, la incidencia alcanza un 40% en el caso de la queratoconjuntivitis atópica y un 46% en el caso de la queratoconjuntivitis vernal, del total de pacientes de alergias oculares en Brasil (Belfort et al, 2000. Acta Ophthalmol Scand. 78: 38-40) . En todas estas enfermedades se han visto alteraciones en los niveles de expresión de mucinas (Argüeso et al, 2002. Invest Opththalmol Vis Sci. 43:1004-1011; Dogru et al, 2005. Curr Eye Res. 30:897-908) . Por otro lado, algunas patologías de la mucosa ocular, pueden ser producidas por el uso continuo de lentes de contacto, las cuales pueden dar lugar a inflamación subclínica y por ello a la disminución de la producción de mucinas (Corrales et al, 2009. Optom Vis Sci. 86:1051-1058) , lo que supone un gran impacto tanto sanitario como social.

Dentro de las mucinas, una de las de mayor relevancia clínica es la mucina MUC5AC, la cual es específica de las células caliciformes de la conjuntiva. La producción de mucina por estas células se encuentra fuertemente disminuida (hasta un 90% de reducción) en diversas enfermedades oculares como por ejemplo la queratoconjuntivitis sicca, el síndrome de Sjögren, el penfigoide, el síndrome de Stevens Johnson (Kunert et al, 2001. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42: 2483-2489) , en pacientes atópicos con úlceras corneales (Dogru et al, 2005. Cornea 24: S18-S23; Dogru et al, 2005. Curr Eye Res. 30: 897-908) También puede verse reducida como consecuencia del desarrollo de síntoma de ojo seco secundario a otras enfermedades o tratamientos oculares (Heimann et al, 2001. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol.

239: 488-495) . Igualmente, la exposición pasiva al humo del tabaco produce una reducción significativa en los niveles de MUC5AC (Rummenie et a, . 2008. Cytokine 43: 200-208) .

En la actualidad no existen tratamientos que permitan la recuperación funcional de la superficie ocular inflamada de forma crónica, sino que los tratamientos existentes solo presentan utilidad para aliviar la sintomatología de las enfermedades. Resulta necesaria la búsqueda de un tratamiento que permita la recuperación de la enfermedad, para lo cual una buena aproximación puede ser el tratamiento de la inflamación subyacente, permitiendo una normalización de la superficie ocular que finalmente permita recuperar los niveles de los componentes que se encuentren alterados. Dentro de esta recuperación de los niveles podría encuadrarse una terapia que permita la recuperación funcional de los niveles de las mucinas.

Debido al elevado absentismo laboral producido por las molestias oculares y la disminución de las facultades visuales, así como al daño psicológico asociado a la pérdida de visión que producen estos problemas crónicos, y a la ausencia de tratamientos efectivos, resultaría altamente beneficioso el desarrollo de una terapia génica que permita una recuperación funcional de las células productoras de mucinas. Esto conllevaría un restablecimiento de los niveles de las mismas y por tanto una recuperación de las enfermedades visuales asociadas a este defecto.

El desarrollo de terapias génicas se ha visto perjudicado por la búsqueda de objetivos muy ambiciosos mediante los cuales se ha tratado de conseguir una respuesta sistémica a los tratamientos genéticos. Sin embargo, un tratamiento más local, permitiría un desarrollo más sencillo de la terapia, y con ello unos mejores resultados mediante una respuesta terapéutica eficiente.

Uno de los mayores problemas a los que se ha enfrentado la terapia génica ha sido el desarrollo de vehículos adecuados. La aproximación a una terapia sistémica resulta compleja y difícil, ya que son múltiples las barreras existentes, y de muy diferente naturaleza dentro de un organismo. Sin embargo un enfoque más local permite reducir las barreras y simplifica la búsqueda del vehículo. Aun a pesar de ello, la necesidad de vehículos adecuados ha sido el mayor problema de la terapia génica (Nathan Blow, 2007. Nature. 450:1117-1120) .

En la actualidad, entre los vehículos más prometedores para el transporte de material genético se encuentran los sistemas nanoparticulares elaborados a base de biomateriales. Estos presentan un gran potencial, aunque hasta la fecha no han proporcionado los resultados esperados. Por ello, resulta necesario el desarrollo de nuevos sistemas capaces de aprovechar su potencial (Friede et al, 2005. Adv Drug Deliv Rev. 57:325-331) .

Uno de los polímeros más utilizados es el quitosano, el cual es un polímero citado como esencial en la formación de nanopartículas mediante reticulación iónica. Las nanopartículas de quitosano están siendo cuestionadas ya que existen estudios que cuestionan su utilidad frente a simples disoluciones... [Seguir leyendo]

1. Nanopartículas poliméricas que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal.

2. Nanopartículas según la reivindicación 1 donde el polinucleótido presenta un 90% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.

3. Nanopartículas según la reivindicación 2 donde el polinucleótido presenta un 95% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.

4. Nanopartículas según la reivindicación 3 donde el polinucleótido presenta un 98% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.

5. Nanopartículas según la reivindicación 4 donde el polinucleótido es SEQ ID NO:2.

6. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicación 1 a 5 donde el polinucleótido se incluye en una construcción genética o un vector.

7. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 formada por al menos:

i) al menos un polímero dotado de carga eléctrica, y ii) un agente reticulante iónico.

8. Nanopartículas según la reivindicación 7 donde el polímero de (i) es gelatina cationizada.

9. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde el agente reticulante iónico es tripolifosfato.

10. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde además comprende un elemento (iii) el cual es al menos un polímero dotado de carga eléctrica opuesta a la del polímero de (i) .

11. Nanopartículas según la reivindicación 10 en la que el polímero del elemento (iii) es sulfato de dextrano o sulfato de condroitino.

12. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde las nanopartículas se encuentran liofilizadas.

13. Uso de nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la elaboración de un medicamento.

14. Uso de nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina.

15. Uso de nanopartículas según la reivindicación 14 donde la mucosa es la mucosa ocular.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 donde la deficiencia de mucina es una deficiencia en MUC5AC.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde la enfermedad se selecciona de la lista que comprende síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxicomedicamentosas, Síndrome de Sjögren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes, atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía o ictiosis.

18. Uso según la reivindicación 17 donde la enfermedad es síndrome de ojo seco.

19. Composición farmacéutica que comprende nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 para su administración vía mucosa ocular, mucosa del tracto gastro-intestinal completo, mucosa de las vías respiratorias, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal.

22. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, la cual se encuentra en forma 5 liofilizada.

23. Uso de una composición farmacéutica según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para la elaboración de un medicamento.

24. Uso de una composición según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para la elaboración

de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una 10 deficiencia de mucina.

25. Uso según la reivindicación 24 donde la mucosa es la mucosa ocular.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25 donde la deficiencia de mucina es una deficiencia en MUC5AC.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 donde la enfermedad se selecciona de la lista que

comprende síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxicomedicamentosas, Síndrome de Sjögren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes, atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía o ictiosis.

28. Uso según la reivindicación 27 donde la enfermedad es síndrome de ojo seco.

FIG. 1A FIG. 1B FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5A

HCE

175, 00 150, 00 125, 00 100, 00 75, 00 50, 00 25, 00 0, 00

C C+ F1 F2 F3

FIG. 5B

IOBA-NHC

175, 0

%>viabilidad>

150, 0 125, 0 100, 0 75, 0 50, 0 25, 0 0, 0

FIG. 6A

100000 10000 1000 100 10 1

HCE

log Expresión relativa del mRNAde la MUC5AC

Control JetPEI + JetPEI + F1 F2 F3 pGFP pMUC5AC

FIG. 6B

log Expresión Relativa del mRNAde la MUC5AC

100000 10000 1000 100 10 1

IOBA-NHC

Control JetPEI + JetPEI + F1 F2 F3 pGFP pMUC5AC

FIG. 7A

HCE

Expresión relativa de MUC5AC (%)

Control JetPEI + JetPEI + F1 F2 F3 pEGFP pMUC5AC

FIG. 7B

IOBA-NHC

Expresión relativa de MUC5AC (%)

FIG. 8