Métodos y reactivos para la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclinas.

Se describe un método in vitro para la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclinas mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa empleando cebadores específicos para el gen de resistencia a tetraciclina A (tetA). De aplicación en la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en muestras ambientales, alimentarias, biológicas y clínicas.

Métodos y reactivos para la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclinas.

Campo de la invención La invención se relaciona con métodos in vitro para la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclinas mediante una reacción de amplificación empleando cebadores específicos para una región del gen de resistencia a tetraciclina A (tetA) . Dichos métodos son útiles en la detección y cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en muestras ambientales, alimentarias, biológicas, clínicas, etc. La invención también se relaciona con un kit para la puesta en práctica de dichos métodos.

Antecedentes de la invención Tras diversas décadas de uso de agentes antimicrobianos, se está empezando a observar la aparición de diversos patógenos multirresistentes (Martinez, J. L., et al. 2009. FEMS Microbiol. Rev. 33:44-65) . Este aspecto es muy importante en producción animal ya que depende del uso de altas cantidades de agentes antimicrobianos para el control de enfermedades, lo que proporciona condiciones favorables para la aparición y diseminación de bacterias resistentes a estos agentes (Aarestrup, F. M. 2005. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 96:271-281) . Se han realizado diferentes estudios (Aarestrup, F. M. 2005. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 96:271-281; White, D. G. 2006. Antimicrobial resistance in pathogenic Escherichia coli from animals. In F. M. Aarestrup (ed.) , Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin, 1st ed. ASM Press, Washington, DC. 145-166) en donde se detalla el riesgo que estas bacterias resistentes suponen para la salud humana, puesto que algunas de estas cepas bacterianas acaban siendo intratables con este tipo de fármacos.

Las tetraciclinas son agentes de amplio espectro que presentan una actividad fundamentalmente bacteriostática y bactericida, en dosis elevadas, frente a un gran número de bacterias gram negativas y positivas. Debido a dicho efecto antimicrobiano, su uso se ha extendido mucho en la terapia de infecciones de animales. Sin embargo, parece que este uso generalizado es la causa de la selección de organismos resistentes (Chopra, I. & M. Roberts. 2001. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65:232-260) .

Los genes que codifican la resistencia a tetraciclinas son transmisibles entre diferentes bacterias pero también desde bacterias de animales de producción a bacterias de los humanos (Aarestrup, F. M. 2005. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 96:271-281) . Así, los determinantes de resistencia a tetraciclina se han extendido entre especies de bacterias identificándose más de 39 especies de bacterias gram negativas y 23 especies de gram positivas (Chopra, I. & M. Roberts. 2001. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65:232-260) .

En el estado de la técnica existen diversos métodos para la cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclinas basados en la detección de diferentes genes. A modo ilustrativo, se ha descrito un método para la detección de bacterias gram negativas resistentes a tetraciclina de diferentes muestras obtenidas de comida de animales y aguas residuales usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y pruebas para los determinantes tetA, tetB y tetC, tetG y tet M, O, P, Q, S, T y W (Yu Z. et al. 2005 Appl. Environ. Microbiology. p. 6926-6933) . Sin embargo, con este método es necesario realizar múltiples pruebas para cuantificar diferentes especies de bacterias.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método de detección de bacterias resistentes a tetraciclina que permita detectar un gran número de especies, subespecies y serovariantes de este tipo de bacterias que sea, a la vez, eficaz, sensible, rápido y económico.

Compendio de la invención Los inventores han diseñado diversas parejas de cebadores y sondas que amplifican una región del gen tetA muy conservada entre diferentes especies de géneros, e incluso a nivel de variante, de bacterias resistentes a tetraciclinas, lo que permite la detección específica de microorganismos resistentes a tetraciclinas, y, en particular, la detección de múltiples especies y serovariantes de bacterias resistentes a tetraciclinas con un único ensayo. La secuencia identificada por los inventores aparece en múltiples especies de bacterias resistentes a tetraciclinas (Figuras 3 y 4) . El empleo de cebadores que amplifican dicha región, en particular, unos cebadores que hibridan con los extremos de dicha región, permite cuantificar en muestras de alimentos las unidades formadoras de colonia con una sensibilidad de hasta 50 ufc/g (unidades formadoras de colonia/gramo) en cultivo puro y de 5x102 ufc/g en carne y pescado (Figuras6y7) .

En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la detección de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra que presenta las características del método identificado en esta descripción como “método 1 de detección de la invención” [véase más adelante].

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la detección de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra que presenta las características del método identificado en esta descripción como “método 2 de detección de la invención” [véase más adelante].

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra que presenta las características del método identificado en esta descripción como “método 1 de cuantificación de la invención” [véase más adelante].

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra que presenta las características del método identificado en esta descripción como “método 2 de cuantificación de la invención” [véase más adelante].

En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido seleccionado del grupo de oligonucleótidos formado por los oligonucleótidos cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y sus combinaciones.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit adecuado para la puesta en práctica de los métodos previamente mencionados. El empleo de dicho kit para la detección y/o cuantificación de bacterias resistentes a las tetraciclinas constituye un aspecto adicional de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Parte de la secuencia del gen tetA. Subrayada aparece la secuencia entre los nucleótidos 592 y 884 (dichos nucleótidos aparecen señalados en negrita) . Los cebadores aparecen marcados. La sonda utilizada para el PCR tiempo real aparece marcada y en negrita.

Figura 2. Secuencia del gen tetB. Subrayada aparece la secuencia entre los nucleótidos 75 y 400 (dichos nucleótidos aparecen señalados en negrita) . Los cebadores aparecen marcados. La sonda utilizada para el PCR tiempo real aparece marcada y en negrita.

Figura 3. Alineamiento de diferentes secuencias de genes de resistencia a tetraciclina A de diferentes especies (número de secuencia indicado a la izquierda de cada secuencia) donde se puede observar la similitud entre las secuencias. La flecha indica el nucleótido 884 de la Figura 1.

Figura 4. Alineamiento de diferentes secuencias de genes de resistencia a tetraciclina B de diferentes especies (número de secuencia indicado a la izquierda de cada secuencia) donde se puede observar la similitud entre las secuencias. La flecha indica el nucleótido 400 de la Figura 2.

Figura 5. Análisis en PCR tiempo real del ADN extraído a partir de diluciones seriadas de un cultivo puro de Escherichia coli BM13 (C600 RifR) /RP4 (tetA) (+) y de Escherichia coli NCTC 50365 (tetB) (.) . Los valores del ciclo umbral se representan frente a la concentración de unidades formadoras de colonias.

Figura 6. Análisis en PCR tiempo real del ADN extraído a partir de diluciones seriadas de una muestra de carne inoculada con Escherichia coli BM13 (C600 RifR) /RP4 (tetA) (+) y de Escherichia coli NCTC 50365 (tetB) (.) . Los valores del ciclo umbral se representan frente a la concentración de unidades formadoras de colonias.

Figura 7. Análisis en PCR tiempo real del ADN extraído a partir de diluciones seriadas de una muestra de pescado inoculado con Escherichia coli BM13 (C600 RifR) /RP4 (tetA) (+) y de Escherichia... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para la detección y/o cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra que comprende

(i) realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada enla SEQ ID NO: 1, y

(ii) detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i) .

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa (iii) para cuantificar dichas bacterias resistentes a tetraciclina.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones1ó2, enelque las bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan de los géneros Acinetobacter, Aeromonas, Edwardsiella, Escherichia, Klebsiella, Laribacter, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio y Yersinia.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a3, enelque dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias patógenas de humanos.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan del grupo de bacterias formado por Acinetobacter baumannii, Aeromonas punctata, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Klebsiella sp., Laribacter hongkongensis, Pseudomonas sp., Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Vibrio sp. y Yersinia ruckeri.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias de la especie Salmonella enterica seleccionadas del grupo formado por Salmonella enterica subsp. enterica serovar Brandenburg, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cholerasuis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin y Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a6, enelque la reacción de amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores capaces de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones2a7, que comprende, además, las siguientes etapas:

a) efectuar diluciones seriadas de unidades formadoras de colonias de un microorganismo control que posee un plásmido que codifica para el gen de resistencia a tetraciclina tetA, b) realizar una curva patrón de las diluciones obtenidas en la etapa a) empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y c) determinar las unidades formadoras de colonias relacionando el resultado de la cuantificación obtenido en la etapa (iii) del método de cuantificación definido en la reivindicación 2 con la curva patrón obtenida en la etapa b) .

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha pareja de cebadores está constituida por un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:2yun cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a9, enelque la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a10, en el que detección del producto de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de una sonda marcada.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha sonda comprende en su extremo 5’ un pigmento reportero y en su extremo 3’ un pigmento quencher.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha sonda comprende en su extremo 3’ un MGB (minor groove binder) .

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a14que comprende además realizar una segunda reacción de amplificación empleando una segunda pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetB comprendida entre el nucleótido 75 y el nucleótido 400 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

16. Método según la reivindicación 15, que comprende además una etapa (iii) para cuantificar dichas bacterias resistentes a tetraciclina.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, en el que las bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan de los géneros Acinetobacter, Aeromonas, Edwardsiella, Escherichia, Klebsiella, Laribacter, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio y Yersinia.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias patógenas de humanos.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan del grupo de bacterias formado por Acinetobacter baumannii, Aeromonas punctata, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Klebsiella sp., Laribacter hongkongensis, Pseudomonas sp., Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Vibrio sp. y Yersinia ruckeri.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias de la especie Salmonella enterica seleccionadas del grupo formado por Salmonella enterica subsp. enterica serovar Brandenburg, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cholerasuis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin y Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que la reacción de amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores capaces de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y/o en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores que los usados para amplificar una región de los genes tetB capaces de amplificar la totalidad o una parte de una región del gen tetB comprendida entre el nucleótido 75 y el nucleótido 400 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, que comprende, además, las siguientes etapas:

a) efectuar diluciones seriadas de unidades formadoras de colonias de un microorganismo control que posee un plásmido que codifica para el gen de resistencia a tetraciclina tetA, b) realizar una curva patrón de las diluciones obtenidas en la etapa a) empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, c) realizar diluciones seriadas de unidades formadores de colonia de un microorganismo control que posee un plásmido que codifica para el gen de resistencia a tetraciclina tetB, d) realizar una curva patrón de las diluciones obtenidas en la etapa c) empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetB comprendida entre el nucleótido 75 y el nucleótido 400 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, y e) determinar las unidades formadoras de colonias relacionando el resultado de la cuantificación obtenida en la etapa (iii) del método de cuantificación definido en la reivindicación 16 con las curvas patrón obtenidas en las etapas b) y d) .

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que la primera pareja de cebadores está constituida por un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3ylasegunda pareja de cebadores está constituida por un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, en el que dicha reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en el que la detección de los productos de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de sondas marcadas.

26. Método según la reivindicación 25, en el que dichas sondas comprenden en su extremo 5’ un pigmento reportero y en su extremo 3’ un pigmento quencher.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dichas sondas comprenden en su extremo 3’ un MGB.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que dicha primera sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 y la segunda sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 8.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que dicha preparación de ácidos nucleicos comprende ADN genómico y/o plasmídico y/o ADNc obtenido a partir del ARN.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que dicha muestra es una muestra ambiental, una muestra alimentaria, una muestra biológica o una muestra clínica.

31. Un oligonucleótido seleccionado del grupo de oligonucleótidos cuya secuencia de nucleótidos se muestra en las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y sus combinaciones.

32. Una pareja de oligonucleótidos seleccionada entre las parejas de oligonucleótidos formadas por:

a) una pareja de oligonucleótidos constituida por un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3; y b) una pareja de oligonucleótidos constituida por un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7.

33. Un kit que comprende una primera pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de una región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en laSEQ IDNO: 1.

34. Kit según la reivindicación 33, que comprende, además, una segunda pareja de cebadores capaz de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetB comprendida entre el nucleótido 75 y el nucleótido 400 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

35. Kit según la reivindicación 34, en el que dicha primera pareja de cebadores está constituida por un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3ylasegunda pareja de cebadores está constituida por un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:6yun cebador que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7.

36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende, al menos, una primera sonda capaz de identificar el producto de amplificación, amplificado mediante una reacción de amplificación en presencia de dicha primera pareja de cebadores y, opcionalmente, una segunda sonda capaz de detectar el producto de amplificación, amplificado mediante una reacción de amplificación en presencia de dicha segunda pareja de cebadores.

37. Kit según la reivindicación 36, en el que dicha primera y/o segunda sonda comprende en su extremo 5’ un pigmento reportero y en su extremo 3’ un pigmento quencher.

38. Kit según la reivindicación 37, en el que dicha sonda comprende en su extremo 3’ un MGB.

39. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en el que dicha primera sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 y dicha segunda sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 8.

40. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, que comprende, además, un primer ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores capaces de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetA comprendida entre el nucleótido 592 y el nucleótido 884 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1yunsegundo ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores capaces de amplificar la totalidad o una parte de la región del gen tetB comprendida entre el nucleótido 75 y el nucleótido 400 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

41. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40 para la detección y/o cuantificación de bacterias resistentes a tetraciclina en una muestra.

42. Uso según la reivindicación 41, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan de los géneros Acinetobacter, Aeromonas, Edwardsiella, Escherichia, Klebsiella, Laribacter, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio y Yersinia.

43. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 41 ó 42, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias patógenas de humanos.

44. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina se seleccionan del grupo de bacterias formado por Acinetobacter baumannii, Aeromonas punctata, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Klebsiella sp., Laribacter hongkongensis, Pseudomonas sp., Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Vibrio sp. y Yersinia ruckeri.

45. Uso según la reivindicación 44, en el que dichas bacterias resistentes a tetraciclina son bacterias de la especie Salmonella enterica seleccionadas del grupo formado por Salmonella enterica subsp. enterica serovar Brandenburg, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cholerasuis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin y Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky.

46. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, en el que dicha muestra es una muestra ambiental, una muestra alimentaria, una muestra biológica o una muestra clínica.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

<120> MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS RESISTEN-TES A TETRACICLINAS

<130> P486ES00

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> Escherichia coli <400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador tetA directo <400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador tetA reverso <400> 3

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Sonda Taqman MGB tetA

<400> 4

<210> 5

<211> 990

<212> DNA

<213> Escherichia coli <400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador directo tetB

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador tetB reverso <400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Sonda Taqman MGB tetB

<400> 8