Un método in vitro de antagonización de la unión de LDCAM y CRTAM,

que comprende exponer célulasque expresan LDCAM o células que expresan CRTAM a un polipéptido de LDCAM soluble, de tal modo que elpéptido de LDCAM soluble bloquee la unión entre LDCAM y CRTAM.

Métodos relacionados con LDCAM y CRTAM.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES ANTERIORES

Esta solicitud reivindica el beneficio según el artículo 119 del título 35 del Código de los Estados Unidos de la solicitud provisional de EE.UU. nº de serie 60/490.027, presentada el 25 de julio de 2003.

ANTECEDENTES

1. Campo de la invención

Las realizaciones de la invención se refieren en general a métodos in vitro de antagonización de la unión de LDCAM y CRTAM y de agonización de los efectos biológicos de la unión de LDCAM a CRTAM, así como a métodos de cribado de antagonistas y agonistas de LDCAM.

2. Descripción de la técnica relacionada

La LDCAM es una molécula de adhesión celular homófila que se ha mostrado que modula la función de linfocitos T interaccionando con una o más moléculas de superficie de linfocitos T, causando así la alteración de la señalización celular. Se ha mostrado que la LDCAM se autoasocia formando un homodímero y se une a B7L-1. Se ha mostrado también que la LDCAM genera aumentos en las poblaciones de linfocitos citolíticos naturales. La solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/778.187, presentada el 6 de febrero de 2001, describe la LDCAM.

La LDCAM se designa también en la materia como Igsf4, TSLC1, SynCAM y de tipo nectina 2 y se ha caracterizado como un miembro de la familia de tipo nectina de receptores de superficie celular de tipo inmunoglobulina y por tener tres dominios C2 de tipo Ig. La cola citoplasmática de los receptores de tipo nectina tiene un sitio de unión de proteína banda 4.1 y un sitio de unión de proteína PDZ. La LDCAM se ha identificado como un gen supresor tumoral eliminado en carcinoma pulmonar no microcítico y por tener homología con NCAM (Gomyo et al. Genomics 62: 139146 (1999) y Kuramochi et al. Nat. Genet. 27 (4) : 427-30 (2001) ; Masuda et al. J. Biol. Chem. 277 (34) : 31014-9 (2002) ) .

Como se describe en la presente memoria, se ha descubierto que la LDCAM se une a CRTAM. La CRTAM se ha descrito como un miembro de la familia de marcadores de superficie celular designado inicialmente como una molécula asociada a linfocitos T limitados a la clase I (CRTAM) como resultado de su patrón de expresión limitado en linfocitos T (patente de EE.UU. nº 5.686.257) . Las técnicas de sustracción de colecciones de ADNc mostraron que los transcritos de ARNm se expresaban por linfocitos T aº TCR+ CD4- CD8- (dobles negativos) de ratón activados, un subconjunto de linfocitos T citolíticos naturales (NKT) . La CRTAM humana se ha identificado también y comparte el mismo patrón de expresión que la molécula de ratón. LPTN y CRTAM exhiben el mismo patrón de expresión en linfocitos T, sugiriendo la existencia de un programa de expresión génica común a los linfocitos T limitados a MHC de clase I (Kennedy, et al., J. Leuk. Bio. 67, 725 (2000) ) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención es como se expone en las reivindicaciones

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra el fenotipado de un nuevo subconjunto de células dendríticas humanas que son la contrapartida humana de las células dendríticas CD8a+ de ratón, que son células presentadoras de antígeno inmunomoduladoras críticas para la presentación cruzada y la tolerancia cruzada.

La Figura 2 es una tabla de los genes compartidos entre las células dendríticas CD8a+ de ratón y las células dendríticas BDCA3+ humanas.

La Figura 3 es una gráfica que muestra que las células dendríticas BDCA3+ humanas son potentes aloestimulantes.

La Figura 4 es una serie de exploraciones por FACS que muestran que el fago 1F12 que expresa scfv se une específicamente a células dendríticas BDCA3+ humanas.

La Figura 5 es una exploración por FACS que ilustra que la proteína de fusión scfv-Fc de 1F12 ("maxicuerpo") retenía especificidad global por LDCAM después de la conversión desde un fago de scfv hasta una proteína de fusión scfv-Fc.

La Figura 6 es la secuencia aminoacídica de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de scfv de 1F12 (scfv anti-LDCAM) .

La Figura 7 es una imagen de un gel de inmunoprecipitación que muestra que la scfv-Fc de 1F12 imunoprecipitaba una glucoproteína de 100 kDa en células dendríticas de ratón derivadas de médula ósea, que se mostró posteriormente que era LDCAM mediante espectrometría de masas.

La Figura 8 es una inmunotransferencia puntual que muestra que el anticuerpo scfv-Fc de 1F12 se une específicamente a LDCAM-Fc recombinante pero no a RANK-Fc no relacionada. Estos resultados muestran que la proteína de fusión scfv-Fc de 1F12 se une específicamente a LDCAM.

La Figura 9 muestra que los linfocitos T CD4+ se anergizaron por LDCAM frente a la activación por mAb anti-CD3 y conA (Figuras 9A y 9C, respectivamente) . Las Figuras 9B, 9D, 9F y 9H muestran que los linfocitos T CD8+ se anergizaron por LDCAM frente a la activación por mAb anti-CD3, conA, PHA y conA + IL-2, respectivamente. Estos estudios muestran que la LDCAM interacciona con una molécula expresada sobre la superficie de linfocitos T activados de manera dependiente del contacto que evita o reprime la activación de linfocitos T por una variedad de estímulos. Estos estudios muestran que la LDCAM es un agente regulador en rutas inflamatorias.

La Figura 10 es una serie de exploraciones por FACS que muestran que LDCAM-Fc se une a linfocitos T CD8+ y en menor medida a linfocitos T CD4+ (Figuras 10D y 10C, respectivamente) , mientras que el anticuerpo scfv-Fc de 1F12 (concretamente, el anticuerpo anti-LDCAM) no lo hace (Las Figuras 10A y 10B son controles isotípicos) . Estos estudios muestran que la LDCAM interacciona con una molécula expresada sobre la superficie de linfocitos T activados de manera dependiente del contacto que evita o reprime la activación de linfocitos T por una variedad de estímulos. Estos estudios muestran que la LDCAM es un agente regulador en rutas inflamatorias.

La Figura 11 es una serie de exploraciones por FACS que muestran que los linfocitos T CD8+ activados por anticuerpos anti-CD3 se unen a LDCAM-Fc a altos niveles (Figura 11A) y solo con unión marginal al anticuerpo scfv-Fc de 1F12 (Figura 11B) . En contraposición, la LDCAM-Fc mostró una unión marginal de LDCAM-Fc (Figura C) y una alta unión de la proteína de fusión scfv-Fc de 1F12 (Figura 11D) . Las células esplénicas CD8+ de ratones tratados con ligando Flt3 mostraron una unión heterogénea tanto de LDCAM-Fc como de scfv-Fc de 1F12 (Figuras 11E y 11F, respectivamente) .

La Figura 12 es una serie de exploraciones por FACS que muestran que la expresión en superficie celular de la contrapartida estructural de LDCAM (CRTAM) se expresa temporalmente sobre la superficie celular de linfocitos T CD4+ y CD8+ activados. Los análisis por FACS mostraron que la expresión en superficie celular de la unión de LDCAM-Fc a su asociado en linfocitos T CD4+ se reducía después de aproximadamente 24 horas (Figuras 12C, 12F y 12I) . De forma interesante, los linfocitos T CD8+ mostraban un fuerte aumento de la expresión en superficie celular de CRTAM 24 horas después de la activación (Figura 12D) y una disminución progresiva de la expresión en superficie celular a las 48 y 72 horas después de la activación (Figuras 12G y 12J, respectivamente) . La expresión de LDCAM sobre la superficie celular de linfocitos T CD4+ y CD8+ activados era mínima y no cambiaba con el tiempo (Figuras 12B, 12E, 12H y 12K) .

Las Figuras 13A y 13B son un gel de una inmunoprecipitación. La Figura 13A es la banda inmunoprecipitada por LDCAM-Fc a partir de CTL activados. La Figura 13B es la banda inmunoprecipitada por scfv-Fc de 1F12 a partir de DC derivadas de médula ósea. Se obtuvieron resultados similares con DC CD8+ esplénicas. Se cortó la banda de la Figura 13A y se analizó por espectrometría de masas, que confirma que la CRTAM es el asociado de la LDCAM.

La Figura 14 es una gráfica que muestra los datos de ELISA que prueban que la LDCAM se une específicamente a la CRTAM.

La Figura 15 representa un ensayo de FACS que ilustra células EL4 que se transdujeron con un vector lentivírico para expresar LDCAM (Figura 15A) o Necl1 (Figura 15B) sobre su superficie celular. Se expusieron las células transducidas a CRTAM-Fc humana recombinante soluble. La Figura 15A muestra que la CRTAM-Fc se une a las células transducidas que expresan LDCAM (línea gruesa) , pero no a las células transducidas para expresar Necl1 (Figura 15B)... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro de antagonización de la unión de LDCAM y CRTAM, que comprende exponer células que expresan LDCAM o células que expresan CRTAM a un polipéptido de LDCAM soluble, de tal modo que el péptido de LDCAM soluble bloquee la unión entre LDCAM y CRTAM.

2. Un método in vitro de antagonización de la unión de LDCAM y CRTAM, que comprende exponer células que expresan LDCAM a un anticuerpo específico de LDCAM, de tal modo que el anticuerpo específico de LDCAM bloquee la unión entre LDCAM y CRTAM.

3. Un método in vitro de agonización de los efectos biológicos de la unión de LDCAM a CRTAM, que comprende exponer células que expresan CRTAM a un anticuerpo específico de CRTAM, de tal modo que el anticuerpo específico de CRTAM se una a CRTAM y active el receptor de CRTAM.

4. Un método in vitro según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo específico de LDCAM comprende una secuencia aminoacídica variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y una secuencia aminoacídica variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13.

5. Un método de cribado de un antagonista o agonista de LDCAM que comprende

(a) combinar un polipéptido de LDCAM aislado con un compuesto de ensayo;

(b) añadir un polipéptido de CRTAM aislado o una célula que expresa un polipéptido de CRTAM; y

(c) determinar la unión relativa entre el polipéptido de LDCAM y el polipéptido de CRTAM o la célula que expresa un polipéptido de CRTAM en presencia y ausencia del compuesto de ensayo.

6. Un método de cribado de un antagonista o agonista de LDCAM que comprende

(a) combinar una célula que expresa un polipéptido de LDCAM con un compuesto de ensayo;

(b) añadir un polipéptido de CRTAM aislado o una célula que expresa un polipéptido de CRTAM; y

(c) determinar la unión relativa entre la célula que expresa polipéptido de LDCAM y el polipéptido de CRTAM o la célula que expresa el polipéptido de CRTAM en presencia o ausencia del compuesto de ensayo.

7. Un método de cribado de un agonista de LDCAM que comprende

(a) combinar un polipéptido de CRTAM aislado o una célula que expresa un polipéptido de CRTAM con un compuesto de ensayo; y

(b) determinar la unión relativa entre el compuesto de ensayo y el polipéptido de CRTAM o una célula que expresa un polipéptido de CRTAM o determinar la activación, proliferación, diferenciación celular, liberación de citocina, regulación positiva de genes o expresión en superficie celular de proteínas causadas por la interacción de la célula que expresa un polipéptido de CRTAM y el compuesto de ensayo.

FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5

Región variable de VH (cadena pesada)

Región variable de VL (cadena ligera)

FIGURA 6

FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA.

9. H FIGURA.

10. F FIGURA.

11. F FIGURA.

12. K FIGURA 13 FIGURA 14

FIGURA 16 FIGURA 17