MÉTODO PARA INACTIVAR AGENTES INFECCIOSOS EN FLUIDOS BIOLÓGICOS.

Método para inactivar agentes infecciosos en fluidos biológicos La presente invención se refiere a un método para inactivar un agente infeccioso, tal como un microorganismo o un virus, que tiene una envoltura lipídica que puede estar presente en un fluido biológico incluyendo sangre o productos sanguíneos tal como plasma. En particular, la presente invención está dirigida hacia un método para inactivar virus de VIH, hepatitis B o C. La presente invención será descrita con referencia particular al virus de VIH; sin embargo, podrá apreciarse que los métodos aquí descritos también pueden ser empleados para el tratamiento e inactivación de otros agentes infecciosos que tienen una envoltura o membrana lipídica y sin que ello suponga limitación alguna de la invención. Antecedentes de la invención Se cree que la enfermedad conocida como Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es causada por un virus llamado Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). El VIH es un virus de ARN. El virus libre de VIH o virión que circula por la sangre comprende un núcleo de nucleoproteína rodeado por una envoltura lipídica protectora. De forma resumida, el ciclo de vida del virus de VIH comienza con la unión del virus de VIH a la membrana de una célula diana que habitualmente es un linfocito T4 o macrófago humano. La envoltura lipídica tiene glicoproteínas virales que reconocen y se unen a receptores CD4 en una superficie de la célula diana. Después de la unión, el virus se desprende de su envoltura lipídica y penetra en la célula hospedante. La transcripción inversa genera una copia lineal de ADN del genoma de ARN viral. El ADN viral se integra entonces en el ADN cromosómico de la célula hospedante. La expresión del ADN integrado general mARN viral que codifica proteínas virales reguladoras y estructurales. Estas proteínas virales se instalan en la superficie de la célula hospedante. A medida que las mismas se abren camino a través de la membrana de la célula hospedante, las partículas del virus adquieren una envoltura lipídica de su hospedante que contiene la glicoproteína de la envoltura necesaria para el reconocimiento y la unión a una célula no infectada. La cantidad de VIH que circula por la sangre se conoce como la carga viral. La carga viral proporciona una indicación de la forma en la cual un paciente está respondiendo a la enfermedad y evalúa el riesgo de progresar hacia SIDA. Se cree que la carga viral tiene una relación directa con las fases de la enfermedad y se ha comprobado que la reducción de la carga viral reduce el grado de progresión de la enfermedad. Los regímenes de tratamiento actuales están destinados a reducir la carga viral mediante el reconocimiento del ciclo reproductivo del virus que porta la célula. Estas terapias son ineficaces contra el virus maduro que circula por la sangre. Los fármacos antivirales para su uso en el tratamiento de VIH han sido diseñados para prevenir o inhibir la réplica viral y generalmente reconocer la unión inicial del virus al linfocito o macrófago T-4, la transcripción del ARN viral a ADN viral y el ensamblaje del nuevo virus durante la reproducción. Una dificultad grande que surge con los tratamientos de VIH existentes es la elevada velocidad de mutación del virus. Un individuo puede portar un número de cepas de VIH diferentes, algunas de las cuales pueden ser resistentes a determinados fármacos antivirales. Durante el tratamiento pueden generarse cepas resistentes. Se ha intentado enfocar las dificultades asociadas con diferentes mutaciones del virus de VIH mediante el uso de una combinación de fármacos que deben tomarse de acuerdo con protocolos estrictos con el fin de que resulten eficaces. Esto introduce dificultades en cuanto a la compatibilidad y la complacencia. Aun más, muchos fármacos presentan efectos secundarios indeseables. Ya se conoce la inactivación de virus que tienen una envoltura lipídica mediante tratamiento con agentes químicos. La sensibilidad de dichos virus a disolventes orgánicos ha sido utilizada como criterio para la clasificación del virus. Se ha observado que el cloroformo es un agente particularmente eficaz a la hora de inactivar virus revestidos con lípidos. Sin embargo, el cloroformo también desnaturaliza las proteínas del plasma y, por tanto, es muy inadecuado para emplearse con fluidos que han de ser administrados a un animal. Las proteínas del plasma incluyen factores de coagulación II, VII, IX, X, plasmina, fibrinógeno (Factor I), IgM, hemoglobina e interferón. La pérdida de estas proteínas tendrá efectos adversos sobre la salud del paciente y puede incluso conducir a la muerte del paciente. La ß-propiolactona es otro disolvente, que aunque inactiva virus revestidos con lípidos también inactiva hasta el 75% del factor proteínico VIII de la sangre, una proteína crítica para la coagulación. Por tanto, se apreciará que la inactivación de virus en fluidos biológicos que han de ser administrados a un animal es muy diferente respecto de la simple esterilización de fluidos y superficies. Esto es debido a la presencia de componentes proteicos deseables en fluidos biológicos. Un importante uso del plasma reside en el tratamiento de 2   pacientes con deficiencias en factores de coagulación. El plasma con bajos niveles de factor VIII es inadecuado para dicho tratamiento terapéutico. Además, la administración de grandes cantidades de proteínas desnaturalizadas a un paciente puede iniciar una respuesta inmunológica que a su vez puede conducir a enfermedades autoinmunes o anticuerpos al propio factor VIII desnaturalizado. El éter dietílico también ha sido propuesto como un disolvente adecuado para la inactivación de virus que tienen una envoltura lipídica. Una de las razones para elegir el éter dietílico es que desde su primer uso como anestésico general se sabe que es normalmente no tóxico. Sin embargo, el éter dietílico es un disolvente de lípidos relativamente pobre, especialmente para moléculas anfífilas tales como fosfolípidos que forman parte de la envoltura lipídica viral. Se ha comprobado que algunos virus tales como poxvirus son potencialmente resistentes al éter dietílico. Además, el éter dietílico tiene un punto de ebullición de 34º C el cual es inferior a la temperatura de la sangre humana. Por tanto, el contacto del éter dietílico con un producto sanguíneo recientemente extraído se traducirá en una vaporización indeseable del éter. En un esfuerzo para mejorar las propiedades solubilizantes de lípidos del éter dietílico, se ha propuesto combinar el éter dietílico con un detergente no iónico. En particular se ha preferido un detergente disponible con el nombre comercial TWEEN 80. El detergente incrementa el contacto entre el éter y los lípidos. También han sido propuestos los di o trialquilfosfatos como agentes inactivadores de virus y se ha comprobado que a este respecto son superiores al éter dietílico. Un inconveniente de los fosfatos es su baja solubilidad en agua (menor del 0,4%). De este modo, con el fin de que estos agentes funcionen de manera eficaz, es necesario utilizar detergentes no iónicos tal como el TWEEN 80 antes mencionado. Sin embargo, el uso de un detergente necesita procedimientos tediosos para su separación. Los procedimientos que han sido propuestos para separar detergentes no iónicos incluyen la diafiltración empleando membranas microporosas que retienen proteínas del plasma, la absorción de componentes deseados del plasma sobre soportes cromatográficos o soportes cromatográficos por afinidad, y la precipitación de proteínas del plasma. El sistema disolvente a base de alquilfosfato/detergente (SD) ha conseguido una amplia aceptación desde su desarrollo en la mitad de la década de 1980 y es utilizado por la American Red Cross en el tratamiento de plasma para inactivar VIH, hepatitis B y C. Las indicaciones para el uso de plasma tratado por el método SD son limitadas e incluyen el tratamiento de pacientes con deficiencias en factores de coagulación para los cuales no se encuentran disponibles preparados concentrados, las deficiencias adquiridas de múltiples factores de coagulación, la inversión del efecto de warfarina y el tratamiento de pacientes con púrpura trombótica trombocitopénica. En el método del proceso SD, el plasma reciente congelado (FFP) es descongelado y filtrado antes de su elección y tratamiento con detergente constituido por 1% de fosfato de tri(n-butilo) y 1% de Triton X-100 durante 4 horas a 30º C. El sistema disolvente/detergente es separado mediante extracción con agente de soja y cromatografía en fase inversa sobre resina C18. El agua se separa por ultrafiltración y el plasma finalmente se filtra en condiciones estériles. Puede apreciarse que la separación del disolvente/detergente es un procedimiento discontinuo largo y tedioso y, al objeto... [Seguir leyendo]

1. Método para reducir la actividad de un agente infeccioso que tiene una envoltura o membrana lipídica, cuyo método comprende: poner en contacto un fluido biológico con un sistema disolvente que comprende un disolvente en el cual son solubles los lípidos y en donde los constituyentes hematológicos y bioquímicos son sustancialmente estables y que es inmiscible con el fluido biológico, durante un tiempo suficiente para reducir los niveles de actividad del agente infeccioso en el fluido; y separar el fluido del sistema disolvente, con lo que los lípidos disueltos son separados con y permanecen en el sistema disolvente, caracterizado porque el sistema disolvente comprende al menos un alcohol, éter, hidrocarburo, amina, éster o una mezcla de estos compuestos. 2. Método según la reivindicación 1, en donde el fluido biológico es sangre, plasma sanguíneo, fracciones de plasma sanguíneo, derivados de células sanguíneas tales como hemoglobina, -interferón, factores de crecimiento, factores de crecimiento de células T, plaquetas derivadas del factor de crecimiento, activador de plasminógeno, precipitados de plasma sanguíneo incluyendo crioprecipitado, precipitado de etanol y precipitado de polietilenglicol, o sobrenadantes tales como criosobrenadante, sobrenadante de etanol y sobrenadante polietilenglicol, semen y suero de mamíferos, en particular suero vacuno fetal. 3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el sistema disolvente es sustancialmente inmiscible en el fluido o producto sanguíneo y la separación del sistema disolvente respecto del fluido o producto sanguíneo incluye dejar que el sistema disolvente y el fluido o producto sanguíneo sedimenten con el fin de formar una capa de disolvente que contiene lípidos y una capa acuosa de plasma, y separar las dos capas. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente infeccioso es un virus. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente infeccioso se elige entre virus VIH, virus de hepatitis B o de hepatitis C, Alphavirus (alfavirus) , Rubivuros (virus de la rubéola), Flavivirus (Flavivirus), Pestivirus (virus de enfermedades mucosales), virus de hepatitis C, sin nombre, Coronavirus (coronavirus), Torovirus (torovirus), Arteivirus (arterivirus), Pararnyxovirus (pararnixovirus), Rubulavirus (ribulavirus), Morbíllivirüs (morbillirvirus), Pneumovirinae (pneumovirus), Pneumovirus (pneumovirus), vesiculovirus (vesiculovirus), Lyssavirus (lisavirus), Ephernerovirus (efemerovirus), Cytorhabdovirus (rhabdovirus de las plantas del grupo A), Nucleorhabdovirus (rhabdovirus de las plantas del grupo B), Filovirus (filovirus), influenzavirus A, B (virus de influenza A y B), influenzavirus C (virus de influenza C), virus de tipo Thogoto sin nombre, Bunyavirus.(buniavirus), Phlebovirus (flebovirus), Nairovirus (nairoviruses), Hantavirus (hantavirus), Tospovirus (tospovirus), Arenavirus (arenavirus), retrovirus tipo B de mamíferos, sin nombre, retrovirus tipo C de mamíferos y reptiles, sin nombre, retrovirus tipo D, Lentivirus (lentivirus), Spumavirus (espumavirus), Orthohepadnavirus (hepadnavirus de mamíferos), Avihepadnavirus (hepadnaviruses de aves), Simplexvirus (simplexvirus), Varicellovirus (varicelovirus). 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el alcohol es un alcohol C1-C8. 7. Método según la reivindicación 6, en donde el alcohol es butanol. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el éter se elige del grupo consistente en etilpropiléter, propiléter, diisopropiléter, dietiléter o una mezcla de los mismos. 9. Método según la reivindicación 8, en donde el éter es diisopropil o dietiléter. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el sistema disolvente comprende de 0% a 60% aproximadamente de alcohol y entre 40 y 100% aproximadamente de éter. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la capa acuosa de plasma se lava con un éter para separar disolvente residual y/o para desemulsionar la capa acuosa. 12