MÉTODO PARA DETECTAR O MEDIR VHB.

Método para medir VHB, método que comprende detectar o cuantificar la presencia de VHB haciendo reaccionar a una muestra de ensayo que contiene VHB con una sonda que reconoce específicamente a un epítopo en los aminoácidos no.

31-49 del polipéptido del núcleo del VHB (HBc) desnaturalizado, cuya secuencia se muestra en la SEC ID NO: 1; en el que partículas de VHB y proteínas relacionadas con el VHB en la muestra de ensayo se desnaturalizan para dejar completamente expuestos a los antígenos HBe y HBc y, cuando anticuerpos para los antígenos HBe y HBc están presentes, dichos anticuerpos están inactivados

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2001/006947.

Solicitante: ADVANCED LIFE SCIENCE INSTITUTE, INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 10-23 Maruyamadai 2-chome Wako-shi Saitama 351-0112 JAPON.

Inventor/es: KIMURA,TATSUJI, YAGI,SHINTARO, MAKI,Noboru, ODA,Yoko.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 10 de Agosto de 2001.

Clasificación PCT:

  • C07K16/08 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales víricos.
  • C12N5/18 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células de murino, p. ej. células de ratón.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
  • G01N33/576 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para la hepatitis.
  • G01N33/577 G01N 33/00 […] › en los que interviene anticuerpos monoclonados.

Clasificación antigua:

  • C07K16/08 C07K 16/00 […] › contra materiales víricos.
  • C12N5/18 C12N 5/00 […] › Células de murino, p. ej. células de ratón.
  • C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
  • G01N33/576 G01N 33/00 […] › para la hepatitis.
  • G01N33/577 G01N 33/00 […] › en los que interviene anticuerpos monoclonados.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.

PDF original: ES-2374812_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a un método para detectar o medir virus de la hepatitis B (VHB). Antecedentes de la técnica La hepatitis post-transfusional se refiere a hepatitis causada por transfusión, como su propio nombre indica, y el virus de la hepatitis B (VHB) es el primer virus identificado como virus causante de hepatitis post-transfusional. En el ensayo de antígenos de VHB, se han utilizado métodos para detectar antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HB) en cribado de sangre, y se han utilizado habitualmente métodos para detectar el antígeno e del virus de la hepatitis B (HBe) como marcador para la replicación del virus de la hepatitis B. El antígeno HBe es una proteína del pre-núcleo (pre-core) expresada por el mismo promotor que el de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B (antígeno HBc) que constituye la partícula de VHB. Dado que esta proteína se produce y se secreta de forma agresiva durante la replicación de VHB, se piensa que la cantidad del antígeno HBe en la sangre refleja en gran medida la cantidad de VHB cuando el anticuerpo contra HBe está ausente. Sin embargo, una vez que la producción del anticuerpo contra HBe se ha iniciado, el antígeno HBe forma un complejo inmune que conduce al establecimiento de seroconversión en la que solamente puede ser detectado el anticuerpo contra HBe. En dichas muestras, no se detecta antígeno HBe y la cantidad de VHB no se refleja. Por otro lado, se han descrito casos en los que, incluso en el estado de seroconversión que indica la quiescencia de hepatitis de tipo B, los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), un indicador de la actividad de hepatitis, pueden variar y dado, que el ADN del VHB se detectó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la presencia de un mutante pre-núcleo se confirmó. Los mutantes pre-núcleo significan que, dado que un codón en la posición 28 de la proteína prepro HBe mutó a un codón de terminación, el antígeno HBe ya no podía producirse o secretarse con un resultado de que el antígeno HBe se volvió negativo. En otras palabras, quedó claro que la medición del antígeno HBe y el anticuerpo en solitario no es suficiente para monitorizar portadores de VHB. Con la extensión de los ensayos de amplificación de ácido nucleico (NAT), se ha prestado atención a la relación entre la cantidad de ADN del VHB y la patología de los portadores de VHB y, por consiguiente, los NAT se han utilizado principalmente para la monitorización después de la medicación con agentes antivirales. Aunque ensayos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como el método de PCR y el método de TMA (Amplificación Basada en Transcripción) son métodos altamente sensibles para detectar fragmentos génicos, sin embargo, son complicados ya que requieren dos horas de tiempo de manipulación para extraer el ADN genómico del VHB de muestras de ensayo en el método manual, e implican varias etapas de procedimientos. Además, dichos complicados procedimientos aumentan las probabilidades de contaminación y, de este modo, aumentaban las posibilidades de muestras falsas positivas. Además, se requieren aptitudes técnicas para obtener valores cuantitativos de manera estable, y hay que prestar suma atención en el almacenamiento de las muestras de ensayo para detectar sustancias bioquímicamente inestables, tales como ADN. Esto hace difícil procesar una gran cantidad de muestras de una vez. Aunque las medidas contra la contaminación han mejorado y el tiempo de procesamiento para la extracción de ADN se ha reducido en los últimos años debido al desarrollo de equipo automatizado, aun se requieren instrumentos caros y, por consiguiente, el método no se ha utilizado generalmente excepto en instalaciones que procesan una gran cantidad de muestras. Además, dado que el cebador de ADN debe concordar con el gen diana, deben utilizarse varios tipos de cebadores, lo que plantea un problema, dado que el coste por ensayo aumenta en comparación con inmunoensayos. En lugar de los métodos anteriores que detectan el genoma del VHB, se han desarrollado métodos para detectar directamente el antígeno del núcleo del VHB (antígeno HBc). Usuda y otros (Journal of Virological Methods [Diario de Métodos Virológicos], 72: 95-103, 1998) desarrollaron un método para detectar el antígeno HBc en el suero utilizando un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por el antígeno del núcleo del VHB (HBc), y demostraron que éste tiene utilidad clínica de forma similar a los anteriores ensayos NAT que detectan el genoma viral. Este método, sin embargo, sigue teniendo problemas en varios puntos. En primer lugar, en comparación con el método NAT, es menos sensible con un límite de detección de 10 5 copias/ml en términos de la cantidad de ADN del VHB y, por lo tanto, no puede utilizarse en ensayos de cribado de suero o monitorización. Además, las etapas de procesamiento de muestras para la medición son complicadas y requieren tiempo, lo que plantea problemas cuando debe utilizarse en aplicaciones tales como cribado y monitorización. Por lo tanto, para el procesamiento de muestras de ensayo (sueros), se requiere un procesamiento de etapas múltiples para la concentración de partículas virales y la eliminación de componentes de suero, incluyendo tratamiento con el 2 E01956848 30-12-2011   anticuerpo policlonal de HBs (37ºC, dos horas), procedimiento de centrifugado (10 minutos), eliminación del sobrenadante, tratamiento con surfactantes, tratamiento alcalino (35 minutos) y la adición de agentes neutralizantes. Dichos procesos requieren aptitudes técnicas altamente experimentadas y para alcanzar la reproducibilidad, aptitudes entrenadas y se requiere un tiempo de procesamiento, como mínimo, de tres horas. Además, debido a etapas de centrifugado, eliminación del sobrenadante etc., el método es refractario a la automatización, y hace difícil la manipulación a granel simultánea, y por lo tanto no es adecuado para aplicaciones que requieren la manipulación a granel desde el punto de vista del procesamiento. Debido a estos problemas, no se ha llevado a la utilización práctica en ensayos de laboratorio. Por otro lado, el sistema de detección del antígeno HBc tiene ventajas respecto al método NAT en los siguientes puntos. Por lo tanto, dado que el proceso de detección no está acompañado por un procedimiento de amplificación, tolera relativamente la contaminación. Además, dado que detecta proteína antigénica que es relativamente estable en lugar de sustancias bioquímicamente inestables tales como ADN, no es necesario tener un cuidado excesivo durante el almacenamiento de muestras de ensayo, lo que permite un transporte más fácil de las mismas. Estas características son requisitos importantes en aplicaciones en las que se miden un gran número de muestras de ensayo, tales como en la gestión de la sangre y revisiones físicas. Sin embargo, el método dado a conocer para detectar el antígeno HBc no es adecuado para la automatización, debido al complicado pretratamiento, y no puede utilizarse en cribado o monitorización terapéutica debido a la baja sensibilidad y, por lo tanto, el método no ha utilizado las ventajas respecto al método NAT en su máxima extensión. Además, los métodos clínicamente útiles de medición deben abordar siempre los problemas de sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, facilidad de manejo y bajo coste y debe desarrollarse de forma intensiva para satisfacer todos estos. La bibliografía hasta la fecha describe anticuerpos que reconocen la región de secuencia de los No. de aminoácidos mostrados en [ ] en el antígeno HBc. [73-89]; A. Semiletov Iu y otros, Bioorg Khim 20 (11), 1175-85 (1994) [124-133], [135-147]; M. Sallberg y otros, J Gen Virol 74 (Pt7), 1335-40 (1993) [N terminal], [134-140]; V. Skrivelis y otros, Scand J Immunol 37 (6), 637-43 (1993) [2-10], [134-140], [138-154]; V. Bichko y otros, Mol Immunol 30(3), 221-31 (1993) [126-135]; M. Sallberg y otros, Mol Immunol 28(7), 719-26 (1991) [76-85]; M. Sallberg y otros, J Med Virol 33(4), 248-52 (1991) [73-85], [107-118]; G. Colucci y otros, J Immunol 141(12), 4376-80 (1988) [9-20], [78-83], [127-133], [133-145]; P. Pushko y otros, Virology 202(2), 912-20 (1994) Utilizando estos anticuerpos junto con un método de pretratamiento de muestras de ensayo, es posible preparar un sistema para medir el antígeno HBc. Sin embargo, aún no se han establecido sistemas de medición altamente sensibles y altamente específicos. Características de la invención Aunque actualmente existen el método de PCR y el método de TMA en el ensayo NAT para VHB, estos tienen los problemas de que el coste de ensayo es alto y además el procedimiento es complicado. Además, dado que utilizan un método de amplificación génica, pueden causar falsos positivos cuando los cebadores para amplificación no son... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para medir VHB, método que comprende detectar o cuantificar la presencia de VHB haciendo reaccionar a una muestra de ensayo que contiene VHB con una sonda que reconoce específicamente a un epítopo en los aminoácidos no. 31-49 del polipéptido del núcleo del VHB (HBc) desnaturalizado, cuya secuencia se muestra en la SEC ID NO: 1; en el que partículas de VHB y proteínas relacionadas con el VHB en la muestra de ensayo se desnaturalizan para dejar completamente expuestos a los antígenos HBe y HBc y, cuando anticuerpos para los antígenos HBe y HBc están presentes, dichos anticuerpos están inactivados. 2. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es un anticuerpo monoclonal producido por la célula de hibridoma HB44 (FERM BP-7232). 3. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. 18 E01956848 30-12-2011

 

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