Método para detectar el antígeno s del virus de la hepatitis B.

Un anticuerpo que reconoce un epitopo localizado sobre un péptido que consiste en una secuencia deaminoácidos que se corresponde con las posiciones 26 a 80 en el antígeno s del virus de la hepatitis B.

Método para detectar el antígeno s del virus de la hepatitis B

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo que reconoce un nuevo epitopo del antígeno s (antígeno HBs) del 5 virus de la hepatitis B (HBV) y a un método in vitro para detectar HBV, o el antígeno HBs, utilizando el anticuerpo.

Antecedentes de la técnica El diagnóstico de una infección vírica se realiza principalmente mediante el método de detectar un virus o un componente relacionado con el virus (proteína o ácido nucleico) , o mediante el método de detectar un anticuerpo específico producido por el cuerpo humano tras una infección vírica.

Normalmente, la infección por HBV puede conocerse confirmando la presencia del antígeno HBs o el anticuerpo HBc. Como indicador no solo de la infección por HBV sino también del estado clínico de un portador de HBV o el juicio de la prognosis y la eficacia del tratamiento, se mide la cantidad del antígeno e del virus de la hepatitis B (antígeno HBe) , un anticuerpo contra el antígeno, o el ADN del HBV (ADN-HBV) .

Entre los antígenos que constituyen las partículas víricas del HBV (partículas de HBV) , el antígeno HBs es una importante proteína de la envuelta constitutiva sobre la superficie de la partícula de HBV infecciosa y está anclada en la bicapa lipídica derivada de hepatocitos en la que la partícula de núcleo que contiene el ADN-HBV está envuelta. En la sangre de un paciente infectado con HBV existen partículas esféricas pequeñas no infecciosas o partículas tubulares formadas por antígenos HBs. Las partículas esféricas pequeñas están presentes de modo más abundante en la sangre, y se observan aproximadamente 100 partículas esféricas pequeñas por cada una o varias partículas de HBV. La mayoría de los agentes de ensayo del antígeno HBs disponibles en el mercado en la actualidad detectan principalmente el antígeno HBs en forma de partículas esféricas pequeñas.

El antígeno HBs es una proteína de membrana que consiste en 226 restos aminoácidos (número de aminoácidos de 1 a 226) y que penetra cuatro veces a través de la bicapa lipídica. Aunque aún no se ha aclarado completamente el modelo de la estructura transmembrana del antígeno HBs, Howard et al. (Howard et al., Viral Hepatitis and Liver 25 Disease (editado por Zuckerman A. J., Alan R.) , pp. 1094-1101, Liss Inc., Nueva York, 1988) han propuesto que el antígeno HBs está compuesto por una región (lado del lumen del RE) , fuera de la bicapa lipídica, que consiste en las posiciones 1 a 11 del extremo N-terminal del antígeno HBs, una región transmembrana hidrófoba que penetra a través de la bicapa lipídica que consiste en las posiciones 12 a 28, una región dentro de la bicapa lipídica que consiste en las posiciones 29 a 80, una región transmembrana hidrófoba que consiste en las posiciones 81 a 97, una región del lumen del RE hidrófila que consiste en las posiciones 98 a 156, y dos regiones transmembrana hidrófobas que consisten en las posiciones 157 a 226 (figura 1) .

Un determinante "a" común principal utilizado para la detección del antígeno HBs en métodos convencionales está colocado en las posiciones de los aminoácidos 110 a 156, contenidos en los aminoácidos en las posiciones 98 a 156 localizados en el lado del lumen del RE, es decir, sobre la superficie de la partícula vírica. Se ha indicado que este determinante "a" común consiste en una estructura de orden superior compleja, en la que están presentes al menos cuatro epitopos (Hiroaki Okamoto, “Nippon Rinsho, Bunshi Kan-En Uirusubyogaku, Kiso-Rinsho-Yobo” (Japanese Clinic, Molecular Hepatitis Virology, Fundamental-Clinic-Prophylaxis) , Lower Volume, Hepatitis A, B, D, E Viruses, pp. 212-222, publicado el 26 de octubre, 1995) .

El HBV es un virus de ADN, pero se sabe que el HBV sufre mutaciones comparables a los virus de ARN porque,

durante la proliferación vírica, su ADN es replicado en ARN, y a partir de este ARN, el ADN es sintetizado por la transcriptasa inversa. Por consiguiente, se considera que, en un individuo infectado por HBV, aparecen mutantes con diversos tipos de mutaciones. Cuando se aplica un estrés selectivo externo, tal como un anticuerpo neutralizante, al HBV en dicho individuo, aparece el fenómeno por que el cual las cepas de HBV sensibles al estrés disminuyen, mientras que los mutantes resistentes o insensibles al estrés aumentan. Los denominados "mutantes de 45 escape", que están resultando problemáticos en los últimos años, son los mutantes que han sufrido una sustitución, deleción o inserción de un aminoácido o aminoácidos en el determinante "a" común principal, por lo cual están dotados de la capacidad para mantener su infección ya que escapan de los anticuerpos que reconocen al determinante "a" antes de la mutación.

Un problema asociado con la aparición de mutantes de escape es que estos mutantes pueden mantener una 50 infección persistente puesto que pueden escapar de un anticuerpo inducido mediante la inoculación de una vacuna que emplea el determinante "a" antes de la mutación.

Otro problema es que estos mutantes de escape no pueden ser detectados con los métodos de reconocimiento del antígeno HBs convencionales. En general, los mutantes de escape que tienen una mutación sobre el determinante "a" común tiene menor reactividad con un anticuerpo monoclonal frente al determinante "a" común en el HBV de tipo 55 salvaje y, así, un anticuerpo monoclonal contra el determinante "a" común de tipo salvaje, utilizado en los métodos de reconocimiento del antígeno HBs convencionales, no puede descubrir realmente una infección de HBV que se está produciendo. Por ejemplo, se ha indicado que un mutante 145Arg, es decir, el mutante en el que el aminoácido en la posición 145 está cambiado de Gly en el tipo salvaje a Arg, tiene una reactividad significativamente menor con un anticuerpo monoclonal contra el determinante "a" común (Hiroaki Okamoto, “Nippon Rinsho, Bunshi Kan-En Uirusubyogaku, Kiso-Rinsho-Yobo” (Japanese Clinic, Molecular Hepatitis Virology, Fundamental-Clinic-Prophylaxis) , Lower Volume, Hepatitis A, B, D, E Viruses, pp. 212-222, publicado el 26 de octubre, 1995) . De hecho, se ha indicado que una transfusión de sangre, la cual se había demostrado que era negativa al antígeno HBs en un ensayo de selección de HBV utilizando el reactivo de medición del antígeno HBs convencional, provocó una infección por HBV (Thiers et al., Lancet, ii, 1273-1276, 1988) .

En la infección aguda por HBV, aparece un fenómeno indicado en el que un paciente infectado por HBV es positivo al antígeno HBs en una etapa inicial de la infección y luego se convierte en negativo al antígeno HBs y simultáneamente se convierte en positivo al anticuerpo HBs. La razón por la cual el paciente se convierte en positivo al anticuerpo HBs es que se produce un anticuerpo contra el determinante "a" común del antígeno HBs en el cuerpo del paciente. El anticuerpo del paciente contra el determinante "a" común se une a la misma región que en el determinante "a" común reconocido por el anticuerpo monoclonal utilizado en el reactivo de ensayo del antígeno HBs, lo cual conduce a la competición entre ambos anticuerpos y, debido a la competición, la sensibilidad del reactivo de ensayo del antígeno HBs se reduce de modo que se evita la detección del HBV por el reactivo de ensayo.

Descripción de la invención Problema que resuelve la invención El reactivo de ensayo del antígeno HBs convencional que emplea un anticuerpo monoclonal contra el determinante "a" común en el HBV de tipo salvaje no puede detectar un mutante de escape que tenga una mutación en el determinante "a" común, y cuando se emplea sangre considerada negativa por este reactivo de ensayo para una transfusión sanguínea, puede provocarse una infección por HBV. Un objeto de la presente invención es desarrollar una sonda capaz de detectar dicho mutante de escape del HBV, y un método para medir el antígeno HBs utilizando la sonda.

Otro objeto de la presente invención es desarrollar una sonda que pueda medir el antígeno HBs sin que lo evite un anticuerpo del paciente contra el determinante "a" común, incluso en una muestra positiva al anticuerpo HBs procedente de un paciente infectado, así como un método para medir el antígeno HBs utilizando la sonda.

Medio para resolver el problema Los presentes inventores han podido solucionar el problema descrito anteriormente utilizando, como sonda, un anticuerpo que reconoce un epitopo localizado sobre un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:1.

Es decir, la presente invención se refiere a una sonda (en lo sucesivo "anticuerpo") que reconoce un epitopo localizado... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que reconoce un epitopo localizado sobre un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que se corresponde con las posiciones 26 a 80 en el antígeno s del virus de la hepatitis B.

2. Un anticuerpo que reconoce un epitopo localizado sobre un péptido que consiste en una secuencia de 5 aminoácidos de SEQ ID NO:1.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, que es capaz de reconocer el antígeno s del virus de la hepatitis B y que puede obtenerse utilizando, como antígeno, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que se corresponde con las posiciones 26 a 80, o que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:1, en el antígeno s del virus de la hepatitis B desnaturalizado con un desnaturalizante.

4. Un método in vitro para detectar el virus de la hepatitis B o el antígeno s del virus de la hepatitis B, que comprende utilizar el anticuerpo descrito en cualquier de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El método de detección según la reivindicación 4, que se realiza en presencia de un desnaturalizante.

6. El método de detección según la reivindicación 4 o 5, en el que el desnaturalizante es un tensioactivo.

7. El método de detección según la reivindicación 4 o 5, en el que la disociación del antígeno s del virus de la hepatitis B y la inactivación de un anticuerpo que se une al antígeno s del virus de la hepatitis B se realizan mediante un tratamiento con un agente de tratamiento que contiene (1) un agente acidificante, y (2) un tensioactivo y/o un desnaturalizante de proteínas como desnaturalizante.

8. El método de detección según la reivindicación 4 o 5, en el que la disociación del antígeno s del virus de la hepatitis B y la inactivación de un anticuerpo que se une al antígeno s del virus de la hepatitis B se realizan mediante un tratamiento con un agente de tratamiento que contiene (1) un agente alcalinizante, y (2) un tensioactivo y/o un desnaturalizante de proteínas como desnaturalizante.

9. El método de detección según la reivindicación 4 o 5, en el que la disociación del antígeno s del virus de la hepatitis B y la inactivación de un anticuerpo que se une al antígeno s del virus de la hepatitis B se realizan mediante un tratamiento con un agente de tratamiento que contiene (1) un agente alcalinizante, y (2) un tensioactivo y/o un desnaturalizante de proteínas y/o un agente reductor como desnaturalizante.

10. El método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que utiliza también un anticuerpo para un antígeno del virus de la hepatitis B distinto del antígeno s del virus de la hepatitis B.

11. Un reactivo para la detección del antígeno s del virus de la hepatitis B, que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un desnaturalizante.

12. Un reactivo para la detección del antígeno s del virus de la hepatitis B, que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un anticuerpo para un antígeno del virus de la hepatitis B distinto del antígeno s del virus de la hepatitis B, y un desnaturalizante.