Un complejo sonda en el que proteínas o polímeros de péptidos con un peso molecular de 2.

000 o más como intermedio hidrófilo está covalentemente unido directamente a un vehículo con un peso molecular de 20.000-4.000.000, y una sonda y una(s) substancia(s) marcada(s) o una(s) substancia(s) capaz(capaces) de unirse a una substancia marcada como marcador de detección están covalentemente unidas directamente al intermedio

Complejo sonda.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una técnica para producir complejos sonda en la que las sondas y los marcadores de detección tales como haptenos o péptidos de bajo peso molecular están unidos a vehículos vía intermedios. Los complejos sonda producidos de este modo encuentran una amplia gama de aplicaciones en medidas inmunológicas que usan reacciones inmunes que incluyen inmunoensayos enzimáticos e inmunohistoquímica.

Antecedentes de la invención

Los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos se han usado como método para detectar auto-antígenos o antígenos extraños en organismos utilizando reacciones inmunológicas entre antígenos y anticuerpos. La alta especificidad y sensibilidad de estos métodos hace posible detectar una pequeña cantidad de substancias en organismos sin aislarlas.

Los métodos inmunohistoquímicos son procedimientos para detectar la localización de antígenos en células y tejidos por medio de reacciones específicas entre antígenos y anticuerpos. Un método inmunohistoquímico ampliamente usado en virtud del método ABC se lleva a cabo según las siguientes etapas. Se preparan secciones de tejido a partir de tejidos congelados o tejidos fijados con parafina. Se someten a bloqueo con seroalbúmina bovina y similares para prevenir la unión no específica. Esto se hace reaccionar con anticuerpos biotinilados que se unen a antígenos de interés para formar complejos inmunes entre antígenos y anticuerpos biotinilados. A los complejos inmunes se añaden enzimas conjugadas con avidina tales como peroxidasa de rábano (HRP) para formar complejos enzimáticos de biotina-avidina y los antígenos de interés se detectan por medio de substratos cromógenos o luminiscentes para las enzimas. Alternativamente, la detección de antígenos de interés se puede conseguir añadiendo a avidina materiales fluorescentes que incluyen fluoresceína o materiales luminiscentes que incluyen ésteres de acridinio.

Los métodos de medida inmunológica para detectar antígenos en muestras biológicas tales como suero se realizarán según las siguientes etapas. Los anticuerpos de captura que se unen con antígenos que se van a medir se inmovilizan a la fase sólida tal como una microplaca. Subsecuentemente, se lleva a cabo el procedimiento de bloqueo con seroalbúmina bovina y similares para prevenir la adsorción no específica a anticuerpos y la fase sólida. Las muestras que contienen antígenos que se van a medir se añaden a esto para unirse los antígenos de interés con los anticuerpos de captura. Los complejos sonda, en los que están unidas las sondas tales como anticuerpos que reconocen los antígenos y haptenos tales como biotina, se añadirán a los antígenos capturados. Esto da como resultado la formación de complejos inmunes, complejos de captura anticuerpo-antígeno-sonda, en una fase sólida tal como una microplaca. La biotina en los complejos inmunes está conjugada con avidina marcada con HRP, y se añaden substratos cromógenos o luminiscentes para HRP para medir los antígenos de interés.

Como se describe anteriormente, los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos usan complejos sonda que comprenden sondas tales como anticuerpos y biotina unida a ellos. Además, se han desarrollado métodos en los que se unen haptenos como dinitrofenilo (DNP), digoxigenina (DIG) o FITC a anticuerpos en lugar de biotina para producir complejos sonda y se conjugan enzimas a anticuerpos que reconocen estos haptenos para detección (véase, por ejemplo, la referencia 1, no patente).

Se han desarrollado inmunoensayos sin el uso de enzimas en los que los complejos sonda se preparan uniendo, en lugar de biotina, substratos fluorescentes tales como fluoresceína y substratos luminiscentes tales como ésteres de acridinio a anticuerpos, la detección se realiza a continuación usando fluorescencia o luminiscencia.

Estos métodos inmunoquímicos e inmunoensayos son métodos de detección específicos y muy sensibles. Sin embargo, hay varias substancias traza en organismos que son difíciles de detectar por métodos generales. Por ejemplo, la concentración en suero de precursores de péptido liberador de gastrina humana (proGRP) en sujetos normales es aproximadamente 14 pg/ml, que indica que se requiere aproximadamente una sensibilidad de 1.000 veces comparado con el antígeno carcinoembriónico (CEA) o α-fetoproteína de los que la concentración en suero en sujetos normales es 5-20 ng/ml. Siendo un antígeno extraño, el nivel viral del virus de hepatitis C (HCV) en sangre es muy bajo, y debido al hecho de que tal sensibilidad se requiere para detectar 100-1.000 copias/ml de ARN viral, que es aproximadamente igual a 0,03-0,3 pq/ml de antígenos nucleares tal como se expresa por la concentración de proteína.

Ha habido intentos de mejora para incrementar la sensibilidad de los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos para detectar substancias traza en organismos. Entre varios factores que pueden influir en el incremento de sensibilidad de los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos, un factor es mejorar las funcionalidades de los complejos sonda a los que se unen las sondas tales como anticuerpos que se unen a los antígenos descritos anteriormente y biotina. Por ejemplo, el incremento del número de moléculas de biotina unidas a una molécula de anticuerpo conducirá al incremento del número de moléculas que incluyen avidina que se une a la biotina y enzimas unidas a la avidina, mejorando por ello las señales cromógenas o luminiscentes para provocar el incremento de sensibili- dad.

Sin embargo, los haptenos se unen directamente a los anticuerpos para preparar complejos sonda convencionales que comprenden sondas tales como anticuerpos y biotina o haptenos unidos a ellos. Por ejemplo, en un método, se hacen reaccionar grupos amino en anticuerpos y ésteres de NHS introducidos en biotina para unir biotina a anticuerpos vía enlace covalente. En este método, los estudios de las condiciones de reacción incrementarán el número de moléculas de biotina unidas a una molécula de anticuerpo. Sin embargo, el número de grupos amino contenidos en los anticuerpos y el número de biotinas que se pueden unir a los anticuerpos están ambos limitados. Además, la biotina unida a grupos amino en la vecindad de determinantes de antígeno de anticuerpos puede provocar efectos adversos en la asociación de anticuerpos con sus antígenos debido al impedimento estérico.

Además, cuando los haptenos que se van a unir son substancias hidrófobas, los complejos sonda en su conjunto tendrán hidrofobicidad mejorada por la unión de muchos haptenos hidrófobos a anticuerpos. Al realizar métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos, la fuerte hidrofobicidad de los complejos sonda conducirá a una unión no específica de los complejos a tejidos o placas debido a la unión hidrófoba y el incremento resultante de fondo previene la consecución de suficiente sensibilidad.

Referencia no patente 1: Harlow E, and Lane, D. "Antibodies: A LABORATORY MANUAL" (U.S.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, p. 340-341.

El documento US 5.216.130 describe un complejo macromolecular para localización de dianas que comprende un núcleo biocompatible, un brazo separador, una molécula diana específica y un procedimiento para producir dicho complejo. Los complejos se pueden usar para detectar sitios de interés clínico usando dispositivos de imagen externos no invasivos.

El documento US 4.778.751 se refiere a un método para medir antígenos circulantes o anticuerpos usando un antígeno específico marcado con un ligando o un anticuerpo específico marcado con un ligando, químicamente unido a una matriz o cadena principal soluble, un anti-antígeno o anti-anticuerpo marcado de otra manera y un anti-ligando en fase sólida dirigido al ligando, unido al antígeno específico o anticuerpo específico.

El documento US 6.252.053 se refiere a un complejo enzima-anticuerpo, en el que una enzima, en la que se introduce un grupo maleimida o grupo tiol, está covalentemente conjugada con un vehículo. El complejo resultante es útil como anticuerpo marcado con enzima, particularmente en inmunoensayo enzimático.

Sumario de la invención

Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar un complejo sonda soluble muy sensible con alta capacidad funcional que asegura la manejabilidad en inmunoensayos de alta sensibilidad.

Para tratar...

1. Un complejo sonda en el que proteínas o polímeros de péptidos con un peso molecular de 2.000 o más como intermedio hidrófilo está covalentemente unido directamente a un vehículo con un peso molecular de 20.000-4.000.000, y una sonda y una(s) substancia(s) marcada(s) o una(s) substancia(s) capaz(capaces) de unirse a una substancia marcada como marcador de detección están covalentemente unidas directamente al intermedio.

2. Un complejo sonda según la reivindicación 1, en el que el marcador de detección tiene un peso molecular de 10.000 o menos.

3. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores de detección son biotinas.

4. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores de detección son haptenos.

5. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores de detección son haptenos, en el que el hapteno es éster de acridinio.

6. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores de detección son substancias fluorescentes o substancias luminiscentes.

7. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores de detección tienen radioisótopos.

8. El complejo sonda según la reivindicación 1 o 2, en el que el marcador de detección tiene materiales fluorescentes y materiales luminiscentes, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC) y éster de acridinio.