Proteína del prenúcleo de HBV que tiene una capacidad de formar partículas similares al núcleo del HBV,

en la que el extremo N de la secuencia de aminoácidos está en la posición -28 y el extremo C está en las posiciones 150-154, en la que dicha proteína del prenúcleo comprende la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID No. 1

Proteína del prenúcleo de HBV capaz de formar partículas.

Sector técnico

La presente invención se refiere a una proteína del prenúcleo de HBV capaz de formar partículas similares al núcleo.

Antecedentes de la técnica

El diagnóstico de infecciones virales se puede llevar a cabo mediante métodos de detección de virus o componentes relacionados con virus (proteínas y ácidos nucleicos) y métodos de determinación de anticuerpos específicos producidos por organismos vivos debido a una infección viral. En la infección del virus de la hepatitis B (HBV), se han introducido en ensayos de laboratorio marcadores de diagnóstico tales como antígeno y anticuerpo HBs, anticuerpo HBc, antígeno y anticuerpo HBe y ADN de HBV.

Generalmente, la presencia de la infección de HBV puede reconocerse mediante el antígeno HBs o el anticuerpo HBc. Se han utilizado determinaciones de antígeno y anticuerpo HBe y la cantidad de ADN de HBV para evaluar no sólo la infectividad de HBV, sino como índices para juzgar patologías y prognosis de portadores de HBV y efectos terapéuticos. Debido a sus procedimientos simples y poco costosos, la medición inmunológica de antígeno y anticuerpo HBe ha sido la más utilizada entre éstas. En mutantes de prenúcleos que no pueden producir o secretar antígeno HBe, sin embargo, existen casos en los que la propagación de HBV es activa, la infectividad e inmunogenicidad son potentes y la patología es activa aunque el antígeno HBe es negativo. Por otra parte, independientemente de si son no modificados o mutantes, la medición de la cantidad de ADN de HBV que refleja el estado de propagación y replicación de HBV es importante, pero presenta los problemas de que los procedimientos de pretratamiento y medición son complicados y carecen de reproducibilidad y estabilidad.

Recientemente, se desarrolló un método de determinación de antígenos relacionados con el núcleo de HBV que se cree que refleja el estado de propagación y replicación de HBV a pesar de la presencia de anticuerpos relacionados con el núcleo de HBV (antígeno HBC y anticuerpo HBe) o la aparición de mutantes. Kimura y otros (Journal of Clinical Microbiology, 40:439-445, 2002) han desarrollado un inmunoensayo que detecta simultáneamente antígeno HBc y antígeno HBe en el suero mediante un pretratamiento simple que utiliza un anticuerpo monoclonal que tiene una especificidad por los antígenos relacionados con el núcleo de HBV (productos génicos del prenúcleo/núcleo de HBV que contienen antígeno HBc y antígeno HBe) y han demostrado que tienen una correlación con el método de ensayo NAT que detecta el genoma del virus.

Según la literatura hasta la fecha, los genes del prenúcleo/núcleo de HBV codifican una proteína que comprende una longitud total de 212 residuos de aminoácidos (aminoácidos -29 a 183, cuando el primer aminoácido del antígeno HBc se fija como 1. Lo mismo se cumple en lo adelante en el presente documento) y tiene un péptido señal de 19 residuos en el extremo N del mismo. El péptido señal comprende residuos de aminoácidos hidrofóbicos y funciona como una secuencia señal para la proteína secretada para la unión a la membrana. En este caso, representa una secuencia que comprende los aminoácidos -29 a -11.

La proteína del prenúcleo, cuando se traduce, pasa a través de la membrana del retículo endoplasmático y, después de escindir el péptido señal del residuo 19, el dominio de unión al extremo C del ácido nucleico se escinde para convertirse en el antígeno HBe (aminoácidos -10 a 149), que se secreta en la sangre. Convencionalmente, este antígeno HBe se cree que está asociado con proteínas del suero tales como albúmina y ?-globulina en la sangre y no se ha reportado que forme partículas de HBV. Además, existen algunos reportes de que el antígeno HBe está involucrado en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, supresión de la replicación del virus, etc., pero no es indispensable para la replicación del HBV y queda mucho por aclarar sobre su función biológica.

El gen del prenúcleo/núcleo de HBV tiene una segunda señal de iniciación de la transcripción y un producto transcripto y traducido a partir de su señal se convierte en el antígeno HBc (aminoácidos 1-183), que, cuando se incorporan al ARN del pregenoma de HBV, forman una cápsida vírica y se recubre con un recubrimiento exterior (envoltura) que comprende antígeno HBs y, a continuación, se libera extracelularmente como partículas de virus completas (partículas de Dane). Se ha reportado que cuando están presentes los aminoácidos de las posiciones 1-144 entre el antígeno HBc, se forman partículas de núcleo y se cree que la molécula que forma las partículas de núcleo del virus infeccioso están comprendidas por una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en las posiciones 1-183.

Aunque el antígeno HBc y el antígeno HBe son proteínas que comparten la mayor parte de las secuencias, presentan propiedades significativamente diferentes. De manera significativa, un residuo de cisteína del aminoácido en la posición -7 del antígeno HBe es responsable de esta diferencia. Esta cisteína, en combinación con el residuo de cisteína del aminoácido en la posición 61 en la misma molécula, forma un enlace disulfuro y adquiere las propiedades de antígeno e (M. Nassal y A. Rieger, Journal of Virology, 67: 4307-4315, 1993). El hecho de que, por ejemplo, cuando la cisteína en la posición -7 se reemplaza con otro aminoácido para prevenir la formación del enlace disulfuro, no se adquiere la conformación de antígeno HBe, lo que indica, además, la importancia de este enlace disulfuro.

Por otra parte, ya que el antígeno HBc se transcribe y traduce del aminoácido en la posición 1, éste no presenta residuo de cisteína en la posición -7 y, de esta manera, adquiere la conformación HBc y dos moléculas de proteína HBc se convierten en un homodímero formando un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en la posición 61 de aminoácidos, formando, de esta manera, una cápsida vírica (partículas de núcleo).

Los antígenos relacionados con el núcleo de HBV presentes en el suero de pacientes con HBV se dividen en antígeno HBc (aminoácidos 1-183), que constituyen la partícula de Dane infecciosa y el antígeno HBe secretor (aminoácidos -10 a 149) que es prácticamente el mismo que el antígeno HBc en términos de secuencia de aminoácidos, pero presenta una antigenicidad diferente a la del antígeno HBc. Sin embargo, además de lo anterior, la presencia del pre-antígeno HBe (aminoácidos -29 a 149) en la sangre que muestra una antigenicidad al HBe como una molécula secundaria ha sido demostrada por Takahashi y otros (Journal of Inmunology, 147, 3156-3160, 1991).

Ellos separaron los sueros agrupados mediante centrifugación y purificaron a parir del sobrenadante una proteína que tiene una antigenicidad HBe utilizando una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal anti-HBe y lo secuenciaron. Tal como se describió anteriormente, se cree que la proteína antígeno HBe está presente en la sangre sin formar partículas de virus. Decidieron, además, la secuencia de antígeno HBe que se purificó sin desprender (romper) el antígeno HBs que es una proteína de recubrimiento de HBV o sin romper las partículas de virus y las partículas de núcleo, y el antígeno HBe que tiene la secuencia de señal (aminoácidos -29 a 149) demostrado por ellos se cree que se encuentren en un estado libre en el suero.

Por otra parte, se ha reportado que, entre las partículas de Dane, hay algunas partículas vacías que no contienen ADN de HBV (SAKAMOTO y otros, Laboratory Investigation, 48, 678-682, 1983) o partículas deficientes de replicación defectuosa que contienen ADN de HBV más corto de lo normal que se sometieron a corte y empalme (TERRE y otros, Journal of Virology, 65, 5539-5543, 1991), pero la proteína de HBV que constituye la partícula no ha sido analizadas en detalle.

Por lo tanto, la caracterización bioquímica de los antígenos relacionados con el núcleo de HBV analizados en la literatura anterior no pueden considerarse suficientes y la forma de los antígenos relacionados con el núcleo de HBV como marcadores de virus en la sangre, que se cree que refleja el estado de propagación y/o replicación de HBV, no han sido resueltas aún.

Divulgación de la invención

Entre los ensayos NAT clínicamente significativos de HBV se encuentran actualmente el método PCR y el método TMA, pero los problemas asociados a los mismos son el alto costo y el complicado procedimiento de ensayo. Además, como se utiliza...

1. Proteína del prenúcleo de HBV que tiene una capacidad de formar partículas similares al núcleo del HBV, en la que el extremo N de la secuencia de aminoácidos está en la posición -28 y el extremo C está en las posiciones 150-154, en la que dicha proteína del prenúcleo comprende la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID No. 1.

2. Partículas similares al núcleo de HBV o partículas similares al virus HBV que comprenden la proteína del prenúcleo de HBV según la reivindicación 1.

3. Método de diagnóstico de infección por HBV que comprende la determinación de un valor cuantitativo de una proteína del prenúcleo de HBV según la reivindicación 1.

4. Método de diagnóstico, según la reivindicación 3, que comprende la etapa de exponer la proteína del prenúcleo de HBV según la reivindicación 1 y la etapa de unión a una sonda que reconoce la proteína del prenúcleo de HBV.

5. Método de diagnóstico, según la reivindicación 3 o reivindicación 4, en el que dicha etapa de exponer la proteína del prenúcleo de HBV es tratamiento con, o adición de, un surfactante.

6. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho surfactante es un surfactante aniónico, un surfactante aniónico y un surfactante anfolítico, o un surfactante aniónico, un surfactante anfolítico y un surfactante no iónico.

7. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha sonda que se une a la proteína del prenúcleo de HBV es una sonda que se une en las posiciones -28 a -11 de la secuencia de aminoácidos, o una sonda que se une específicamente a la proteína del prenúcleo de HBV, según la reivindicación1, y que no se une al antígeno HBe o al antígeno HBc.

8. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que dicha sonda que se une a la proteína del prenúcleo de HBV es un anticuerpo

9. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para determinar proteína del prenúcleo/núcleo de HBV particulada que comprende además la etapa de inmunoprecipitación con una sonda tal como un anticuerpo anti-HBs que se une al antígeno HBs y determinar la proteína del prenúcleo/núcleo de HBV en el precipitado.

10. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el valor de la proteína del prenúcleo/núcleo de HBV particulada se calcula midiendo además el valor del antígeno HBe y restando el valor medido del antígeno HBe cuando el valor del antígeno HBe se incluye en el valor medido de la proteína del prenúcleo de HBV determinada mediante un método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

11. Método de diagnóstico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el valor de la proteína del prenúcleo/núcleo de HBV particulada se calcula midiendo además el valor del antígeno HBe y restando el valor medido del antígeno HBe del valor medido de la proteína del prenúcleo/núcleo de HBV determinada mediante un método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.