Procedimiento para la cuantificación inmunoquímica de antígenos inmunorreactivos inactivados.

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR INMUNOQUIMICAMENTE ANTIGENOS INMUNOREACTIVOS,

INACTIVADOS, QUE SE EMPLEAN PARA PROVOCAR UNA RESPUESTA INMUNE EN MAMIFEROS Y HUMANOS.

Procedimiento para la cuantificación inmunoquímica de antígenos inmunorreactivos inactivados.

La invención se refiere a un procedimiento para la cuantificación inmunoquímica de antígenos inmunorreactivos inactivados, que se usan para provocar una respuesta inmune en mamíferos y seres humanos.

Las vacunas contra enfermedades que son originadas por virus o microorganismos, contienen una cantidad determinada de antígeno, cuya administración conduce a una respuesta inmune en el animal o en el ser humano vacunado. Como esta respuesta inmune depende de la dosis, en una vacuna es condición previa una determinada cantidad de antígeno para su eficacia. Hasta ahora, habitualmente, se efectúa la comprobación del contenido de antígeno en la vacuna en ensayos de protección in vivo y en el futuro, cada vez más, en procedimientos in vitro; el contenido de antígeno se cuantifica durante la producción, preferentemente, mediante determinación de proteínas, determinación del número de gérmenes/partículas o por reacción de inmunoprecipitación para mezclar/ajustar la vacuna.

En el sentido de esta invención, microorganismos son microorganismos patógenos y virus, contra cuya patogenicidad en mamíferos y seres humanos puede lograrse una inmunidad parcial o total mediante la vacunación con componentes de microorganismos o virus inactivados o microorganismos o virus enteros inactivados. La vacuna es eficaz por su contenido en determinadas estructuras antigénicas.

Por ello, la comprobación de estos antígenos en una vacuna, en particular, si fue tratada por agentes inactivantes apropiados, y la determinación cuantitativa de estos antígenos mediante procedimientos inmunológicos indica la eficacia de la vacuna.

Así, por ejemplo, debido a reglamentos legales y similares, por ejemplo, dictámenes CPMP, debe determinarse en el envase definitivo la cantidad de hemaglutinina en una vacuna contra influenza, que normalmente está compuesta por tres diferentes cepas de virus de influenza, mediante un ensayo de inmunodifusión o mediante otro procedimiento apropiado (dictamen CPMP). El ensayo de inmunodifusión se usa generalmente como Técnica de inmunodifusión radial simple (SRD) (G. C. SCHILD y col. (1975), A single-radial-inmuno-diffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin. Proposals for an assay method for the haemagglutinin content of influenza vaccines, Boletín de la Organización Mundial de la Salud 53, 223-231.).

Se demostró ahora que algunas vacunas de influenza, evidentemente debido a la forma física de la hemaglutinina, grandes complejos moleculares que se forman durante la escisión de los virus mediante disolventes lipídicos y la subsiguiente inactivación mediante formaldehído, no pueden ser analizados en el ensayo SRD (GANDHI, S.S. (1978), The effect of formaldehyde treatment of influenza virus on the assay of its haemagglutinin antigen content by the single-radial-immunodiffusion (SRD) technique, J. Biological Standardization 6, 121-126). Puede ser una explicación, que los grandes complejos moleculares en la agarosa se difunden menos que moléculas menores y así simulan un contenido menor de antígeno.

Pero antígenos de otras vacunas contra enfermedades causadas por virus o microorganismos frecuentemente tampoco pueden cuantificarse, o no pueden cuantificarse de forma exacta, mediante los procedimientos conocidos hasta ahora. Por tanto, la invención se basa en el objetivo de encontrar un procedimiento de cuantificación que, independientemente de los procedimientos usados para la inactivación de la vacuna, de forma segura y fiable proporcione resultados de mediciones comparables con patrones primarios como, por ejemplo, los reactivos NIBSC del Instituto Nacional de Patrones y Control Biológicos (por encargo de la OMS).

Sorprendentemente, se demuestra ahora que se alcanza el objetivo planteado mediante un procedimiento de comprobación en el que el antígeno (los antígenos) que se ha(n) de comprobar se fijan(n) por adsorción a una fase sólida y la parte del antígeno fijado se determina mediante uno o varios anticuerpos marcados directa o indirectamente.

En J. Immunol. (1980) 125 1583-1588 se describe un procedimiento para la identificación de determinantes de antígenos del virus de influenza HA. En D11 se escinde HA con bromocianógeno y se evalúa la capacidad del fragmento de interactuar con anticuerpos generados contra virus de influenza purificado. La escisión de HA con bromocianógeno no conduce a la formación de complejos moleculares de hemaglutinina.

En Acta. Virology (1978) 22 371-382 se evalúa la capacidad de suero de conejos producido contra virus intacto de influenza o HA purificada, de interactuar con HA1 y HA2 purificadas. La HA1 y HA2 purificadas se preparan mediante filtración en gel de HA purificada en guanidina 6 M. D12 describe que los sueros interactúan tanto con HA1 como con HA2. HA1 y HA2 unívocamente son subunidades de HA y no complejos moleculares de HA.

En Immunology and Cell Biology (1992) 70 181-191 se evalúa la eficacia de transferencias Western para la comprobación de reacciones de anticuerpos en el ratón y en el ser humano contra las proteínas de viriones de influenza HA1, HA2 y HA no escindida. Se prepararon las proteínas a partir de virus purificado mediante mezclado con SDS para la electroforesis en condiciones reductoras y no reductoras, y mediante ebullición de 2 minutos de duración. La inactivación con SDS no conduce a complejos moleculares de hemaglutinina.

En Vopr. Virusol. (1985) 30 672-675 se describe un sistema de ensayo para la comprobación y la determinación cuantitativa de hemaglutinina de virus de influenza (HA) en muestras biológicas, mediante un inmunoensayo de enzima en fase sólida. Se liga el antígeno que contiene HA de forma inmunoquímica a una matriz de poliestireno.

En Biological (1990) 18 321-330 se describe un procedimiento para determinar el grado antigénico de una vacuna contra la rabia, mediante la determinación cuantitativa de la gluco-proteína similar a la hemaglutinina que contiene éste. Se inactiva el virus con BPL, un procedimiento de inactivación que no conduce a la formación de complejos moleculares de hemaglutinina.

Arch. Virol. (1989) 108 169-182 describe una comprobación inmunológica de hemaglutininas de influenza reticuladas mediante formaldehído mediante una transferencia Western de PAGE con anticuerpos policlonales específicos de HA1 y HA2.

Por ello, el objeto de esta invención es un procedimiento para la cuantificación inmunoquímica de complejos moleculares de hemaglutinina inmunorreactivos inactivados de virus de influenza, que comprende los siguientes pasos:

Aquí se prefiere un procedimiento de este tipo en el que se comprueban antígenos de un microorganismo o virus mediante la reacción con un anticuerpo policlonal o uno monoclonal, o una mezcla de anticuerpos monoclonales que portan el mismo marcaje.

Además, se prefiere un procedimiento de este tipo en el que pueden detectarse antígenos de un microorganismo o virus mediante una reacción con anticuerpos policlonales o monoclonales específicos, en una mezcla de diferentes microorganismos o virus.

También se prefiere un procedimiento de este tipo, en el que pueden comprobarse por separado antígenos de diferentes microorganismos o virus mediante una reacción con diferentes anticuerpos policlonales... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la cuantificación inmunoquímica de complejos moleculares de hemaglutinina inmunorreactivos inactivados de virus de influenza, que comprende los siguientes pasos:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra contiene complejos moleculares de hemaglutinina de tres diferentes virus de influenza.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se comprueban los complejos moleculares de hemaglutinina de un virus de influenza mediante la reacción con un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, o una mezcla de anticuerpos monoclonales que portan el mismo marcaje.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se comprueban los complejos moleculares de hemaglutinina mediante una reacción con anticuerpos específicos policlonales o monoclonales, en una mezcla de diferentes microorganismos o virus.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se comprueban de forma separada complejos moleculares de hemaglutinina de diferentes virus de influenza, mediante una reacción con diferentes anticuerpos policlonales o monoclonales, que de forma correspondiente a su especificidad por los complejos moleculares de hemaglutinina de diferentes virus de influenza, portan diferentes marcajes.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida está compuesta por poliestireno, nilón o nitrocelulosa.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida se encuentra en partículas.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una placa de microtitulación.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una membrana de nilón o de nitrocelulosa, preferentemente, de nitrocelulosa.