CÉLULAS ANIMALES Y PROCEDIMIENTOS DE REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA GRIPE.

SE DESCRIBEN CELULAS ANIMALES QUE PUEDEN SER INFECTADAS POR VIRUS DE LA GRIPE Y QUE ESTAN ADAPTADAS PARA CRECER EN SUSPENSION EN UN MEDIO EXENTO DE SUERO.

SE DESCRIBEN ADEMAS PROCEDIMIENTOS PARA LA REPLICACION DE VIRUS DE LA GRIPE EN UN CULTIVO CELULAR, UTILIZANDO DICHAS CELULAS, ASI COMO VACUNAS QUE CONTIENEN LOS VIRUS DE LA GRIPE OBTENIDOS MEDIANTE DICHO PROCEDIMIENTO O CONSTITUYENTES DE LOS MISMOS

La presente invención se refiere a células MDCK que pueden infectarse con el virus de la gripe y que están adaptadas al crecimiento en suspensión en medio sin suero, y a procedimientos para la producción de una vacuna para el virus de la gripe en cultivo celular usando estas células. La presente divulgación se refiere además a virus de la gripe que se pueden obtener mediante el procedimiento descrito y a vacunas que contienen virus de este tipo

o constituyentes de los mismos.

Todas las vacunas de la gripe que se han usado desde la década de 1940 hasta hoy en día como vacunas permitidas para el tratamiento de seres humanos y animales constan de una o más cepas de virus que se han replicado en huevos de gallinas embrionados. Estos virus se aíslan del líquido alantoideo de huevos de gallinas infectadas y sus antígenos se usan como vacuna, bien en forma de partículas de virus intactos o como partículas de virus desintegrados con detergentes y/o disolventes, la denominada vacuna fragmentada, o en forma de proteínas aisladas de virus, la denominada vacuna en subunidad. En todas las vacunas permitidas, los virus se inactivan mediante procedimientos conocidos para el experto en la técnica. La replicación de los virus vivos atenuados, que se analizan en vacunas experimentales, también se lleva a cabo en huevos de gallina embrionados.

El uso de los huevos de gallina embrionados para la producción de vacunas requiere tiempo y es laborioso y costoso. Los huevos, de bandadas de gallinas sanas monitorizadas por veterinarios, tienen que incubarse antes de la infección, habitualmente durante 12 días. Antes de la infección se tienen que seleccionar los huevos con respecto a los embriones vivos, ya que sólo estos huevos son adecuados para la replicación del virus. Después de la infección se incuban de nuevo los huevos, habitualmente durante de 2 a 3 días. Se mata a los embriones todavía vivos en este momento con frío y, después, se obtiene el fluido alantoideo de cada huevo individual mediante aspiración. Por medio de laboriosos procedimientos de purificación, las sustancias del huevo de gallina que dan lugar a efectos secundarios indeseados de la vacuna se separan de los virus y se concentran los virus. Como los huevos no son estériles (sin patógenos), es, adicionalmente, necesario eliminar y/o inactivar los pirógenos y todos los patógenos que posiblemente estén presentes.

Los virus de otras vacunas, tales como, por ejemplo, los virus de la rabia, de las paperas, del sarampión, de la rubéola, de la polio y los virus FSME se pueden replicar en cultivos celulares. Dado que los cultivos celulares que proceden de bancos de células analizadas no presentan patógenos y, en contraste con los huevos de gallina, son un sistema de replicación de virus definido que (en teoría) están disponibles en cantidades casi ilimitadas, posibilitan la replicación de virus económica en ciertas circunstancias, incluso en el caso del virus de la gripe.

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Posiblemente, la producción económica de vacunas también se puede conseguir en cuanto a que el aislamiento y purificación de un medio de cultivo celulares estéril definido parece más sencillo del procedente del líquido alantoideo que contiene gran cantidad de proteínas.

El aislamiento y la replicación de los virus de la gripe en huevos conducen a una selección de ciertos fenotipos, la mayoría de los cuales difiere del aislamiento clínico. En contraste con ello se encuentra el aislamiento y la replicación de los virus en cultivo celular, en el que no se produce ninguna selección dependiente de pases (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1991), 185 189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047 -2051). Por tanto, para una vacuna eficaz también se prefiere en este aspecto la replicación de virus en cultivo celular por encima de en huevos.

Se sabe que los virus de la gripe se pueden replicar en cultivos celulares. Además de las células de embrión de gallina y las células de hámster (BHK21-F y HKCC), se ha descrito que las células MDBK, en particular las células MDCK, son células adecuadas para la replicación in vitro de los virus de la gripe (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas 89 -110, Plenum Medicak Book Company -New York y London, 1987). Por ejemplo, Merten y col. (1996) advances in Experimental Medicine and Biology, páginas141-151, da a concer la producción de virus de la gripe en células BHK-21/BRS, Vero y MDCK. Las células BHK 21/BRS se cultivaron en cultivo en suspensión; las células Vero y MDCK se cultivaron en microtransportadores. Un requisito previo para el éxito de una infección es la adición de proteasas al medio de infección, preferentemente tripsina o serín proteasas similares, ya que estas proteasas escinden extracelularmente la proteína precursora de la hemaglutinina [HA0] en hemaglutinina activa [HA1 y HA2]. Sólo la hemaglutinina escindida conduce a la absorción de los virus de la gripe en las células, con la posterior asimilación del virus en las células (Tobita, K. y col., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9 -14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1975) 440 -454; Klenk, H. D. y col., Virology 68 (1975) 426 -439) y, por tanto, a otro ciclo de replicación del virus en el cultivo celular.

La patente de EE.UU. US 4 500 513 describió la replicación de virus de la gripe en cultivos celulares de células en crecimiento adherente. Tras la proliferación celular, el medio nutriente se elimina y se añade medio nutriente fresco a las células, y de forma simultánea o poco después tiene lugar la infección de las células con virus de la gripe. Un tiempo dado después de la infección se añade proteasa (p. ej., tripsina) con el fin de obtener una replicación óptima del virus. Los virus se recogen, purifican y procesan, para dar la vacuna inactivada o atenuada. No obstante, la replicación económica del virus de la gripe como requisito previo para la producción de vacunas no se puede conseguir usando la metodología descrita en la patente mencionada, dado que el cambio de medio, la posterior infección, así como la adición de tripsina

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que se lleva a cabo más tarde necesitan abrir los vasos de cultivo celular individuales y, por tanto, es muy laboriosa. Además, el peligro de contaminación del cultivo celular con microorganismos y virus indeseados aumenta con cada manipulación de los vasos de cultivo. Una alternativa más rentable es la proliferación celular en los sistemas fermentadores conocida para el experto en la técnica, en los que las células crecen de forma adherente en los microtransportadores. No obstante, el suero necesario para el crecimiento de las células en los microtransportadores (habitualmente suero bovino fetal) contiene inhibidores de tripsina, de modo que incluso en este procedimiento de producción se necesita un cambio de medio a medio sin suero con el fin de conseguir la escisión de la hemaglutinina de la gripe por la tripsina y, por tanto, una replicación del virus adecuadamente alta. Por tanto, esta metodología también requiere abrir los vasos de cultivo varias veces y, por tanto, conlleva el incremento del peligro de contaminación.

Por tanto, la presente invención se basa en el objeto de hacer disponibles células y procedimientos que posibiliten la producción sencilla y económica de una vacuna del virus de la gripe.

Este objeto se consigue mediante la condición de las formas de realización indicadas en las reivindicaciones adjuntas. La invención usa células MDCK que se pueden infectar con virus de la gripe y que están adaptadas al crecimiento en suspensión en medio sin suero. Se encontró que es posible, con la ayuda de células de este tipo, replicar virus de la gripe en cultivo celular de un modo sencillo y económico. Mediante el uso de estas células, por un lado se puede obviar un cambio de medio antes de la infección para eliminar el suero y, por otro, se puede llevar a cabo la adición de proteasa simultáneamente a la infección. En total, de este modo sólo es necesaria una única apertura del vaso de cultivo para infectar con virus de la gripe, de modo que el peligro de contaminación de los cultivos celulares se reduce drásticamente. De forma adicional se disminuye el gasto de esfuerzo que llevaría asociado el cambio de medio, la infección y la posterior adición de proteasa. Otra ventaja es que el consumo de medio se reduce marcadamente.

Las células de acuerdo con la invención son células que derivan de células MDCK cells (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), y, particularmente, preferentemente células de la línea celular...

1. Línea celular MDCK 33016, DSM ACC2219.

2. Un procedimiento para la producción de una vacuna contra el virus de la gripe, que comprende:

(i) células en proliferación en medio sin suero en suspensión;

(ii) infección de las células con virus de la gripe;

(iii) poco antes de la infección, simultáneamente con la infección o poco después de la infección, adición a la suspensión celular de una proteasa para escindir la proteína precursora de la hemaglutinina [HAD];

(iv) tras una fase adicional de cultivo, aislamiento de los virus de la gripe replicados en las células; y

(v) formulación de los virus de la gripe aislados para dar una vacuna para la administración a seres humanos o animales; en el que las células pueden infectarse con los virus de la gripe y se han seleccionado a partir de células MDCK para adaptarlas al crecimiento en suspensión en medio sin suero.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el cultivo de las células tiene lugar en un sistema de perfusión o un procedimiento discontinuo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el pH del medio de cultivo en la etapa (i) está en el intervalo de 6,6 a 7,8.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el pH del medio de cultivo está en el intervalo de 6,8 a 7,3.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la infección con virus de la gripe se lleva a cabo cuando el cultivo celular ha alcanzado una densidad celular de aproximadamente 8 a 25 x 105 células/ml (procedimiento discontinuo) o de aproximadamente 5 a 20 x 106 células/ml (procedimiento de perfusión).

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la infección de las células con virus de la gripe se lleva a cabo a m.d.i (multiplicidad de infección) de aproximadamente 0,001 a 10.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la infección se lleva a cabo a una m.d.i de aproximadamente 0,002 a 0,5.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la proteasa es una serín proteasa.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la serín proteasa es tripsina.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la tripsina se añade hasta una concentración final en el medio de cultivo de entre 1 y 200 µg/ml.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el la concentración final de tripsina en el medio de cultivo está en el intervalo de 5 a 50 µg/ml.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que las células infectadas están cultivadas durante 2 a 10 días.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que las células infectadas se cultivan durante de 3 a 7 días.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que las células infectadas se cultivan entre 30ºC y 36 ºC.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las células infectadas se cultivan a entre 32ºC y 34ºC.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en el que la recolección y aislamiento de los virus replicados se lleva a cabo de 2 a 10 días después de la infección,

18. El procedimiento de la reivindicación 17,en el que la recolección y aislamiento de los virus se lleva a cabo de 3 a 7 días después de la infección.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en el que las células son de la línea celular MDCK 33016, DSM ACC2219.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que la vacuna contiene un adyuvante.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la vacuna contiene partículas de virus intactas, virus inactivados o proteínas aisladas del virus.