PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION A ESCALA INDUSTRIAL DE VACUNAS.

Procedimiento para la preparación a escala industrial de vacunas,

en el que: (a) un cultivo de MDCK en suspensión se multiplica en un medio libre de suero, libre de proteínas o químicamente definido, en el que (i) la multiplicación se realiza en un sistema por lotes alimentados, (ii) el volumen de cultivo se aumenta mediante la adición de medio fresco, y (iii) se consigue un volumen de producción de 100-10.000 l, (b) el cultivo de MDCK en suspensión se infecta con un virus, (c) los virus se multiplican en el cultivo de MDCK en suspensión, y (d) se aíslan del cultivo celular los virus o una proteína producida por éstos

La invención se refiere a procedimiento para la preparación a escala industrial de vacunas.

Las enfermedades infecciosas, especialmente las infecciones virales, tienen al igual que antes una gran importancia médica. Por tanto, sigue existiendo la necesidad invariable de poner a disposición mejores procedimientos mediante los cuales puedan multiplicarse virus en cultivo para hacer posible la investigación de virus y la preparación de vacunas. Especialmente la producción de vacunas contra infección viral requiere normalmente la multiplicación y el aislamiento de grandes cantidades del virus en cuestión.

En función del virus respectivo, en el estado de la técnica se usan diferentes sistemas huésped y condiciones de cultivo para la multiplicación de virus. Como sistemas huésped se usan animales huésped estándar, huevos de gallina embrionarios, cultivos primarios de células de tejido

o líneas celulares establecidas permanentes (Rolle y Mayr [editores], Mikrobiologie, Infektions-und Seuchenlehre, 1978; Mahy [editor], Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek [editor] Kompendium der allgemeine Virologie, 1985).

La multiplicación de virus en huevos de gallina embrionarios está ligada a un alto consumo de tiempo y de costes. Los huevos deben incubarse antes de la infección y a continuación probarse para la viabilidad de los embriones. Sólo los embriones vivos pueden multiplicar virus. Después de realizarse la infección con el virus que va a multiplicarse y la posterior incubación, los embriones se matan finalmente. Los virus que pueden aislarse de los huevos se liberan de contaminantes y se concentran. Como la multiplicación de virus en huevos incubados no es posible bajo condiciones estrictamente estériles, los microorganismos patógenos contaminantes deben eliminarse de las cepas aisladas, siempre y cuando éstos deban estar disponibles para una aplicación médica o diagnóstica.

Las células huésped eucariotas de líneas celulares definidas ofrecen una alternativa a la multiplicación de virus en huevos de gallina (Gregersen, J.P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser y Müller [editores], 2000, páginas 257-281). Sin embargo, debido a las persistentes contaminaciones por virus extraños o debido a la falta de pruebas de la ausencia de virus de origen e historia poco claros, numerosas líneas celulares no son adecuadas para la preparación de vacunas o preparados similares que puedan usarse médicamente.

Por el contrario, en el caso de las células Vero derivadas de células renales de monos se trata de un sistema huésped que ya se usa en la multiplicación de virus individuales (virus de la poliomielitis, virus de la rabia) para la preparación de vacunas. Estas células pueden obtenerse en diversos bancos de células (como, por ejemplo, de la Colección americana de cultivos tipo, ATCC) y además también están a disposición por la Organización Mundial de la Salud (OMS) de un banco de células probado para investigación médica.

En el caso de estas células Vero se trata de líneas adherentes que para su crecimiento necesitan superficies de soporte como, por ejemplo, frascos de cristal, placas de cultivo de plástico o frascos de plástico. En un cultivo de células correspondientes, en el fermentador se realiza el crecimiento en los llamados microsoportes, es decir, esférulas de plástico generalmente pequeñas sobre cuya superficie pueden crecer las células.

Se sabe que, además de las células Vero anteriormente mencionadas, también pueden multiplicarse activamente, por ejemplo, células BHK adherentes (“Baby Hamster Kidney” de riñón de hámster bebé) y MDCK adherentes (“Madin Darby Canine Kidney” de riñón canino de Madin Darby) y otras células de varios tipos de virus y usarse para el uso como sustrato para la preparación de productos farmacéuticos o considerarse su uso. En la ATCC CRL34 (NBL-2) de la línea celular MDCK también se multiplicaron experimentalmente, además de virus de la gripe, el virus de la estomatitis vesicular, el virus Coxsackie B5 (pero no B3 ni B4), el tipo de reovirus 2 y 3, el tipo de adenovirus 4 y 5, así como el virus de la variolovacuna. Sin embargo, todas las publicaciones correspondientes se fijan exclusivamente en cultivos adherentes (véase la información de producto de ATCC). Sin embargo, para la multiplicación de mayores cantidades de células se prefiere el cultivo en suspensión, pudiendo multiplicarse hasta la fecha sólo las células linfoides y algunas transformadas en este sistema (Lindl [editor], Zell-und Gewebekultur, 2000, páginas 173 y siguientes). Una línea celular MDCK que puede crecer en medios de cultivo en suspensión libres de proteínas se da a conocer en el documento WO 97/37000. También se describe la multiplicación de virus de la gripe usando las células huésped correspondientes.

Además de la selección de un sistema de células o huésped adecuado, también son de gran importancia las condiciones de cultivo bajo las cuales se multiplica una cepa de virus para alcanzar un rendimiento alto aceptable. Por tanto, para maximizar el rendimiento de la cepa de virus deseada deben adaptarse específicamente tanto el sistema huésped como las condiciones de cultivo para alcanzar condiciones medioambientales favorables para la cepa de virus deseada. Por tanto, para conseguir un alto rendimiento de las distintas cepas de virus se necesita un sistema que logre condiciones de crecimiento óptimas. Muchos virus están limitados a sistemas huésped especiales de los que algunos son muy ineficaces en cuanto al rendimiento de virus. Además, los sistemas de producción eficientes se basan frecuentemente en adaptaciones de la población de virus al sistema de cultivo respectivo usando frecuentemente etapas intermedias usando otros sistemas huésped y usando aditivos de proteínas – la mayoría de las veces suero – de origen animal o humano.

Además, los expertos saben que casi todos los cultivos celulares después de la multiplicación inicial con adición de suero u otros factores de crecimiento pueden mantenerse al menos durante un cierto tiempo sin adiciones de suero o de proteínas. Así, por ejemplo, un cultivo celular discrecional puede transferirse en el momento de la infección con el virus o poco antes de la cosecha a un medio sin suero o aditivos de proteínas y mantenerse hasta la cosecha. Esto es desde hace años práctica habitual para obtener material de virus para vacunas o pruebas diagnósticas evitando o reduciendo las proteínas extrañas. Las vacunas de cultivos celulares que se mantuvieron sin esta práctica durante la fase de infección con adición de suero tendrán grandes problemas para que la aplicación sea aprobada en seres humanos o animales ya que los constituyentes del suero apenas pueden eliminarse suficientemente (véanse las recomendaciones de la OMS “Proposed requirements for Measles Vaccine” (Live), Requirements for Biological Subtances, nº 12, revisión de 1978).

También se sabe que algunos virus pueden multiplicarse sólo muy escasamente o incluso no pueden multiplicarse en medios que contienen proteínas. A este respecto se trata de aquellos virus que para su multiplicación en sistemas de cultivo dependen de la actividad de enzimas proteolíticas (proteasas). Como estas proteasas se inhiben competitivamente mediante las adiciones de proteínas al medio, lógicamente aquí queda descartada la adición de proteínas al menos desde el momento de la infección o la fase de producción. Ejemplos de virus que normalmente deben multiplicarse con la adición de proteasas y, por tanto, para conseguir buenos rendimientos a ser posible sin aditivos de proteínas al medio de infección son virus de la gripe y rotavirus. Otros tipos de virus como, por ejemplo, paramixovirus y reovirus también pueden beneficiarse durante la multiplicación de medios a ser posible pobres en proteínas (Ward y col. (1984) J.Clin.Microbiol. 748-753 “Efficiency of Human Rotavirus Propagation in Cell Culture”). El documento WO 96/15231 propone cultivar células Vero y otras células en cultivo celular debiendo usarse un medio que se las arregla sin los aditivos de proteínas habituales.

Otros virus pueden multiplicarse de manera notoriamente pésima independientemente de la composición del medio y de las condiciones de cultivo, por ejemplo, virus de la rabia, rotavirus, pneumovirus o de la hepatitis A (Provost y Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160:213-221 (1979); y Rolle y Mayr, en el lugar citado).

Finalmente, en el estado de la técnica se conocen numerosos procedimientos mediante los...

1. Procedimiento para la preparación a escala industrial de vacunas, en el que:

(a) un cultivo de MDCK en suspensión se multiplica en un medio libre de suero, libre de proteínas o químicamente definido, en el que

(i) la multiplicación se realiza en un sistema por lotes alimentados,

(ii) el volumen de cultivo se aumenta mediante la adición de medio fresco, y

(iii) se consigue un volumen de producción de 100-10.000 l,

(b) el cultivo de MDCK en suspensión se infecta con un virus,

(c) los virus se multiplican en el cultivo de MDCK en suspensión, y

(d) se aíslan del cultivo celular los virus o una proteína producida por éstos. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los virus se inactivan con β-propiolactona.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la multiplicación de las células se realiza antes de la infección en un medio químicamente definido y después de la infección en un medio libre de proteínas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1-3, caracterizado porque las células MDCK proceden de la línea celular MDCK-33016.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque en el caso del virus se trata de un virus de ADNm, ADNb, ARN(+), ARN(-) o ARNb.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el virus se selecciona de adenovirus, orto o paramixovirus, reovirus, picornavirus, enterovirus, flavivirus, arenavirus, virus del herpes o poxvirus.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el virus es un adenovirus, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A, virus de la encefalitis japonesa, un virus de la encefalitis centroeuropea, así como las formas orientales relacionadas, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la rubéola, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, virus de la variolovacuna, virus de la gripe, rotavirus, rabdovirus, pneumovirus, reovirus, virus del herpes simple 1 ó 2, citomegalovirus, virus de la varicela-zóster, adenovirus canino, virus de Epstein-Barr, un virus del herpes bovino o porcino o un virus de la pseudorrabia.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la vacuna se mezcla con un adyuvante, coadyuvante, tampón, diluyente o excipiente de fármaco.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-8 que comprende además una etapa (d) en la que los virus se purifican mediante una columna en cromatografía de CS y/o con una ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa.