MULTIPLICACION DE VIRUS EN UN CULTIVO CELULAR.

Procedimiento para preparar un medicamento o agente de diagnóstico,

que comprende pasos en los cuales

(a) se infectan células MDCK con un virus;

(b) después de la infección se cultivan las células MDCK en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células mediante un incremento del volumen total del cultivo,

en donde el virus está seleccionado del grupo consistente en virus de la meningoencefalitis primaveroestival europea (FMSE) y de las formas orientales (rusa u otras) relacionadas, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la hepatitis A, o rotavirus

Multiplicación de virus en un cultivo celular.

La invención se refiere a procedimientos para multiplicar virus seleccionados en cultivo celular, en los cuales se infectan con un virus células MDCK y tras la infección se cultivan las células en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células. La invención se refiere además al empleo de los virus que se pueden obtener así, o de proteínas expresadas por los mismos, para preparar medicamentos y agentes de diagnóstico.

Las enfermedades infecciosas, en especial las infecciones víricas, han tenido siempre gran importancia médica. Por tanto, sigue existiendo de manera inalterada la necesidad de poner a disposición mejores procedimientos mediante los cuales se puedan multiplicar virus en cultivo, para permitir la investigación de los virus y la preparación de vacunas. En especial, la producción de vacunas contra infección vírica requiere habitualmente la multiplicación y aislamiento de grandes cantidades del virus en cuestión.

Dependiendo del virus de que se trate, en el estado de la técnica se emplean distintos sistemas de hospedamiento y condiciones de cultivo para la multiplicación del virus. Habitualmente, como sistemas de hospedamiento se utilizan animales hospedantes, huevos de gallina embrionizados, cultivos de células tisulares primarios o establecidos, líneas celulares permanentes (Rolle y Mayr [compiladores], Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 1978; Mahy [compilador], Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek [compilador] Kompendium der allgemeine Virologie, 1985).

La multiplicación de virus en huevos de gallina embrionizados conlleva elevados gastos en tiempo y costes económicos. Antes de la infección hay que empollar los huevos y después se debe comprobar la viabilidad de los embriones. Sólo los embriones vivos están en condiciones de multiplicar virus. Una vez conseguida la infección con el virus a multiplicar, y tras continuar empollando durante un tiempo adicional, finalmente se mata a los embriones. Se liberan de impurezas los virus aislables de los huevos, y se concentran. Puesto que la multiplicación de virus en huevos empollados no es posible en condiciones estrictamente estériles, se deben eliminar de los aislados los microorganismos patógenos contaminantes, si aquéllos han de llegar a una aplicación médica o diagnóstica.

Las líneas celulares definidas de células hospedantes eucarióticas ofrecen una alternativa a la multiplicación de virus en huevos de gallina (Gregersen, J.P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser y Müller [compiladores], 2000, páginas 257-281). Sin embargo, gran número de líneas celulares no son adecuadas para la preparación de vacunas o preparados similares con aplicación médica, a causa de persistentes contaminaciones con virus extraños o a causa de una deficiente evidencia de estar libres de virus, o por un origen o historia inciertos.

Los procedimientos utilizados en el estado de la técnica para multiplicar virus en cultivo celular presentan todos el mismo esquema básico, en el cual primera-mente se multiplican las células en ausencia del virus, a continuación se añade el virus y se multiplica en condiciones en las cuales no tiene lugar una multiplicación significativa de las células, y se cosecha el cultivo después de la máxima multiplicación de los virus.

Por ejemplo, para multiplicar algunos virus (poliovirus, virus de la rabia) con el fin de preparar vacunas, se han utilizado células Vero derivadas de células renales de mono. Estas células se pueden conseguir en diversos bancos de células (por ejemplo la colección estadounidense de cultivos tipo, American Type Culture Collection, ATCC), y además han sido puestas a disposición de la investigación médica por la Organización Mundial de la salud (OMS) procedentes de un banco de células verificado.

Estas células Vero son líneas adherentes, que precisan para crecer superficies de soporte tales como, por ejemplo, frascos de vidrio, placas de cultivo de plástico, o frascos de plástico. En caso de cultivar células correspondientes en un fermentador, el crecimiento se lleva a cabo sobre los denominados microsoportes, es decir, por regla general pequeñas esférulas de material sintético, sobre cuya superficie pueden crecer las células.

Es sabido que, además de las células Vero antes mencionadas, también células BHK (de riñón de cría de hámster, "Baby Hamster Kidney") adherentes y células MDCK (células renales caninas Madin Darby, "Madin Darby Canine Kidney") adherentes, y otras células, pueden multiplicar activamente varias clases de virus, y se han empleado, o se ha considerado su empleo como sustrato para la producción de productos farmacéuticos. En la línea de células MDCK, ATCC CRL34 (NBL-2), se han multiplicado experimentalmente, además del virus de la gripe, también el virus de la estomatitis vesicular, el virus de Coxsackie B5 (pero no el B3 o el B4), el reovirus tipo 2 y tipo 3, el adenovirus tipo 4 y tipo 5, y virus de la viruela vacuna. Sin embargo, todas las publicaciones correspondientes están dirigidas exclusivamente a cultivos adherentes (véase la información de producto de ATCC). Sin embargo, para la multiplicación de mayores cantidades de células se prefiere el cultivo en suspensión, habiendo sido posible hasta la fecha multiplicar en este sistema sólo las células linfoides y varias células transformadas (Lindl [compilador], Zell- und Gewebekultur, 2000, página 173 y siguientes). En el documento WO 97/37000 se divulga una línea celular MDCK que puede crecer en suspensión en medios de cultivo exentos de proteína. La multiplicación de virus de la gripe mediante el empleo de las correspondientes células hospedantes está asimismo descrita.

Además de la elección de un sistema de células u hospedante adecuado, para conseguir un rendimiento aceptablemente elevado también son muy importantes las condiciones de cultivo en las cuales se multiplica una cepa vírica. Por tanto, para maximizar el rendimiento de la cepa vírica deseada, deben estar específicamente ajustados tanto el sistema hospedante como las condiciones de cultivo, a fin de lograr condiciones ambientales favorables para la cepa vírica deseada. Así, para lograr un rendimiento elevado de las distintas cepas víricas, es necesario un sistema que cree condiciones de crecimiento óptimas. Muchos virus están limitados a sistemas hospedantes especiales, algunos de los cuales son muy poco eficientes en cuanto al rendimiento vírico. Además, los sistemas de producción eficientes se basan frecuentemente en adaptaciones de la población vírica al sistema de cultivo respectivo, a menudo haciendo uso de etapas intermedias que utilizan otros sistemas hospedantes, y aplicando aditivos proteínicos - suero en la mayoría de los casos - de origen animal o humano.

Además, es conocido para los especialistas en el tema que, después de la multiplicación inicial en que se añade suero u otros factores de crecimiento, casi todos los cultivos celulares pueden mantenerse al menos durante cierto tiempo sin adiciones de suero o proteínas. Así, por ejemplo, un cultivo celular cualquiera se puede transformar, en el momento de la infección vírica o poco tiempo antes de la recolección, a medio sin suero ni aditivos proteínicos, y mantenerse así hasta dicha recolección. Esta es la práctica habitual desde hace años para, evitando o reduciendo las proteínas extrañas, obtener material vírico para vacunas o ensayos de diagnóstico. Las vacunas procedentes de cultivos celulares que han sido obtenidas sin esta práctica, añadiendo suero durante la fase de infección, presentan grandes problemas para que se admita su uso en personas o animales, ya que de ellas casi no se pueden eliminar de manera suficiente los componentes del suero (véanse las recomendaciones de la OMS "Proposed requirements for Measles Vaccine (Live)" [requisitos propuestos para la vacuna (viva) contra el sarampión], Requirements for Biological Subtances No.12, revisado en 1978).

También es sabido que muchos virus se pueden multiplicar sólo deficientemente, o incluso no se pueden multiplicar en absoluto, en medios que contienen proteína. Se trata en estos casos de virus que, para ser multiplicados en sistemas de cultivo, dependen de la actividad de enzimas que escinden proteínas (proteasas). Al ser inhibidas competitivamente estas proteasas por las adiciones proteicas al medio, lógicamente está vedada la adición de proteínas, al menos desde el momento de la infección o la fase de producción....

1. Procedimiento para preparar un medicamento o agente de diagnóstico, que comprende pasos en los cuales