Un procedimiento para la preparación de una vacuna de influenza a partir de virus de influenza que se desarrolla en un cultivo de una línea de células Vero,

que comprende una etapa en la cual el virus sembrado y/o la vacuna y/o el cultivo se ensaya para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha línea de células, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso es uno o más de los patógenos siguientes: Pneumovirinae; Metaneumovirus de la familia Paramyxovirinae; Rubalavirus de la familia Paramyxoviridiae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus; bacterias Chlamydia; Reoviridae de mamíferos

CAMPO TECNICO

La presente invención se refiere a la producción y control de calidad de vacunas de virus de influenza.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA

Los virus de influenza para uso en la preparación de vacunas humanas se han desarrollado tradicionalmente sobre huevos de gallina embrionados, aunque las técnicas más modernas desarrollan el virus en cultivo de células de mamífero, por ejemplo, sobre células Vero, células MDCK o células PER.C6. El cambio en el substrato de desarrollo del virus ha proporcionado una oportunidad para la re-evaluación reglamentaria de la seguridad de la vacuna de influenza. Por ejemplo, la contaminación con ADN de la célula huésped ha sido un asunto a reglamentar para las vacunas obtenidas a partir de células [1], pero no ha sido un asunto en el pasado para las vacunas desarrolladas en huevos.

Los principios de seguridad que rodean a las vacunas de influenza obtenidas a partir de huevos son, en consecuencia, diferentes de las que rodean a las vacunas desarrolladas en cultivo de células, estando las vacunas obtenidas a partir de células bajo un escrutinio más estrecho. Es un objeto de la invención el enfrentarse a estos principios de seguridad diferentes, y en particular, el de proporcionar procedimientos para potenciar la seguridad del desarrollo de vacunas de influenza sobre cultivo de células.

Levandowski (Developments in Biological Standardization, vol. 98, págs. 171-75, (1999)), expone principios de seguridad relacionados con la producción de vacuna de influenza en cultivos de células (Ver, MDCK). Se reconoce el problema de agentes accidentales replicantes en líneas de células pero no en huevos. Por ello, se sugiere rastrear las fuentes originales de virus de influenza así como los cultivos de células para ciertos agentes víricos.

DIVULGACION DE LA INVENCION

Por definición, el uso de substratos de células de mamíferos para la producción de vacuna de influenza implica el cultivo de células bajo condiciones que estén bien adecuadas para el desarrollo y replicación vírica. El inventor ha comprobado que estas condiciones incrementan el riesgo de que puedan desarrollarse patógenos diferentes del virus de influenza en el cultivo de células, dando lugar, con ello, a la contaminación potencial del producto de vacuna final. Los ensayos para la contaminación no son generalmente difíciles de llevar a cabo, pero un fabricante debe conocer en primer lugar el tipo de ensayos a realizar. El inventor ha identificado riesgos de contaminación específicos, y su trabajo indica que pueden llevarse a cabo ensayos adecuados durante la fabricación con el fin de asegurar la seguridad y calidad de vacunas de influenza desarrolladas sobre cultivo de células. Algunos de los contaminantes pueden ser inocuos en un producto de vacuna final, pero su presencia puede interferir con la propagación y purificación posterior del virus influenza y, en consecuencia, su eliminación es un asunto primordial para la calidad y reproducibilidad; otros contaminantes serían perjudiciales en una vacuna final y, en consecuencia, su eliminación es un asunto de seguridad primordial.

El riesgo de contaminación que surge del co-cultivo vírico no carece de precedentes (por ejemplo, ciertos lotes de las primeras vacunas de virus de la polio se contaminaron con virus símico 40 (“SV40”), un virus de polioma), pero no existía ninguna divulgación previa sobre la identificación de riesgos específicos asociados con el cultivo de células para la producción de vacuna de influenza humana. Los virus de influenza desarrollados sobre cultivo de células se encuentran en riesgo particular de contaminación debido a que las cepas usadas para la producción de vacuna están cambiando cada año y, en consecuencia, han de establecerse nuevos cultivos cada año. Este cambio anual en los materiales de producción significa que cada nuevo año entraña un nuevo riesgo de contaminación, particularmente debido a que están implicados múltiples pases durante la preparación de virus sembrados por los fabricantes, incrementándose, en consecuencia, el riesgo de desarrollo paralelo de agentes patógenos accidentales.

El inventor ha identificado agentes infecciosos que pueden desarrollarse en las condiciones usadas para el desarrollo de virus de influenza en cultivo de células, pero que no se desarrollan en huevos de gallina. Estos agentes infecciosos representan un nuevo riesgo de contaminación para vacunas de influenza que nunca ha concernido a las vacunas de influenza tradicionales. De acuerdo con ello, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna de influenza a partir de virus de influenza que se desarrolla en un cultivo de una línea de células Vero, que comprende una etapa en la cual el virus sembrado y/o la vacuna y/o el cultivo es ensayado para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha línea de células, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso es uno o más de los patógenos siguientes: Pneumovirinae; Metaneumovirus de la familia Paramyxovirinae; Rubalavirus de la familia Paramyxoviridiae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus; bacterias Chlamydia; Reoviridae de mamíferos.

El inventor ha identificado igualmente agentes infecciosos que se desarrollan en algunos substratos de células usados para la producción de vacuna de influenza pero no se desarrollan en otros. De acuerdo con ello, estos agentes infecciosos son un riesgo de contaminación únicamente para ciertas vacunas de influenza.

La línea de células de mamífero

Las vacunas de influenza de la invención se desarrollan en líneas de células de mamífero, mejor que las que han sido desarrolladas en huevos embrionados. Las líneas de células para el desarrollo de virus de influenza son células Vero [6-8], obtenidas a partir de riñón del mono verde africano (Cercopithecus aethiops).

Estas líneas de células se encuentran ampliamente disponibles, por ejemplo, de la colección del American Type Cell Culture (ATCC) [10], o del Coriell Cell Repositories [11]. Por ejemplo, la ATCC suministra diversas células Vero diferentes bajo los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587.

Agentes infecciosos que no se desarrollan en huevos de gallina embrionados

El inventor ha identificado una variedad de patógenos que pueden desarrollarse en líneas de células de mamífero (en particular, tanto en células MDCK como en células Vero) usadas para la preparación de virus de influenza para la producción de vacunas, pero que no se desarrollan en huevos de gallina. El ensayo para contaminación por estos patógenos no fue necesario para vacunas preparadas sobre el substrato de huevo tradicional, pero el inventor ha comprobado que el control de calidad de las vacunas debería incluir ensayos para uno o más de estos patógenos con el fin de asegurar las normas de seguridad más exigentes. Los patógenos son los siguientes:

■ Pneumovirinae, tales como los del género Pneumovirus, incluyendo el virus sincitial respiratorio (RSV).

■ Morbilivirus de la familia Paramyxoviridiae, tal como virus del sarampión.

■ Enterovirus de la familia Picornaviridiae, tal como el virus Coxsackie, virus ECHO y enterovirus, aunque algunos virus Coxsackie (por ejemplo, B3, B4) se ha encontrado que no se desarrollan en células MDCK.

■ Reoviridae de mamífero, en particular ortoreovirus (por ejemplo, reovirus de mamífero) y rotavirus. Los reovirus pueden mostrar desarrollo no restringido en células Vero y MDCK, y en consecuencia, el ensayo de los mismos es de particular importancia. Los rotavirus comparten las exigencias de proteasa de los virus de influenza con el fin de desarrollarse en cultivo de células, y este paralelismo podría dar lugar de manera inconsciente a la activación de rotavirus contaminantes.

En los casos en que estos patógenos tienen cepas diferentes que tienen huéspedes diferentes (por ejemplo, RSV humano y RSV bovino), el ensayo incumbirá típicamente a cepa(s) que puedan infectar a humanos.

El ensayo para estos agentes es particularmente importante para cepas víricas obtenidas a partir de técnicas genéticas inversas, ya que los virus sembrados para la fabricación de virus experimentarán múltiples pases en el cultivo de células de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de una vacuna de influenza a partir de virus de influenza que se desarrolla en un cultivo de una línea de células Vero, que comprende una etapa en la cual el virus sembrado y/o la vacuna y/o el cultivo se ensaya para determinar la presencia de un agente infeccioso que puede desarrollarse en dicha

5 línea de células, pero que no se desarrolla en huevos de gallina embrionados, en el que dicho agente infeccioso es uno

o más de los patógenos siguientes: Pneumovirinae; Metaneumovirus de la familia Paramyxovirinae; Rubalavirus de la familia Paramyxoviridiae; Coronaviridae; Rhinovirus de la familia Picornaviridae; virus de Varicella Zoster; virus de polioma BK, virus de polioma JC; virus ECHO; virus Coxsackie de los Enterovirus de la familia Picornaviridae; Rotavirus; Picornavirus porcino; Parvovirus; Circovirus; bacterias Chlamydia; Reoviridae de mamíferos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente infeccioso es uno o más de los patógenos siguientes: metaneumovirus humano (HMPV); virus de la parotiditis; virus sincitial respiratorio (RSV); coronavirus humano; coronavirus SARS; cepas M de Rinovirus; virus vesicular porcino (SVDV); Parovirus canino; virus Teschen-Talfan; C. trachomatis; C. pneumoniae; C. psittaci.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además una o más de las etapas siguientes: una etapa de inactivación; una etapa de mezclado de tres cepas de virus para obtener una vacuna trivalente; una etapa de formulación de la vacuna para inyección; una etapa de combinación de la vacuna con un adyuvante; una etapa de medición del contenido en HA; una etapa de ajuste del contenido en HA, por ejemplo, por dilución; una etapa de adición de un conservante; una etapa de eliminación de los ácidos nucléicos de la célula huésped residuales.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo se ensaya mediante 20 detección inmunoquímica; ensayos de inoculación de cultivos de células y/o detección de acción nucléico.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la detección es mediante ELISA y/o PCR.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo se lleva a cabo en una de las fases siguientes: infección vírica, fases de desarrollo, recolección vírica, tratamiento vírico, desdoblamiento, extracción de proteína de superficie, formulación de vacuna, envasado de vacuna.