Un procedimiento de preparación de una vacuna contra el virus de la gripe formulada en una forma subviriónica que comprende proteínas inmunogénicas derivadas de un virus de la gripe propagado en un cultivo celular que comprende:

(i) añadir un agente alquilante para degradar el ADN de cultivo celular funcional residual y también inactivar el virus. (ii) modificar o fragmentar el virus completo con una concentración modificadora de un agente de fragmentación; y (iii) aislar las proteínas inmunogénicas

Campo técnico

La presente invención proporciona procedimientos que dan como resultado productos y procedimientos de cultivos celulares mejorados con impurezas reducidas. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanece asociado con el producto generado en el cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, tal como β-propiolactona (BPL). Este proceso puede usarse para tratar una diversidad de productos de cultivos celulares que incluyen vacunas y proteínas recombinantes.

Antecedentes de la técnica

La producción comercial de vacunas virales requiere típicamente grandes cantidades de virus como fuente de antígeno. Las cantidades comerciales de virus para la producción de vacunas pueden conseguirse por cultivo y replicación de un virus de semilla en un sistema de cultivo celular. Los sistemas de cultivo celulares adecuados para la replicación viral incluyen células de mamíferos, de aves o de insectos, prefiriéndose particularmente los sistemas de cultivo celulares de mamíferos para las vacunas virales para garantizar la correcta glucosilación y plegamiento de las proteínas antigénicas virales. Por similares razones, también se prefieren los sistemas de cultivo celulares de mamíferos para la expresión de proteínas recombinantes.

Si no se modifican de su estado de origen natural, los cultivos celulares tienen una capacidad limitada para reproducirse y por consiguiente son poco prácticos e ineficaces para producir la cantidad de material necesario para una vacuna o proteína recombinante comercial. Por consiguiente, con fines de fabricación, se prefiere que las células se modifiquen para ser líneas celulares "continuas" o "inmortalizadas" para aumentar el número de veces que pueden dividirse. Muchas de estas modificaciones emplean mecanismos similares a los que están implicados en células oncogénicas. Como tal, existe una preocupación de que cualquier material residual de los procesos de cultivo celular, tal como ADN celular del huésped, pueda eliminarse de la formulación final de un producto de vacuna o de proteína recombinante fabricado en estos sistemas.

Un modo convencional para eliminar ADN celular residual del huésped es por tratamiento con DNasa. Un procedimiento conveniente de este tipo se desvela en la Patente Europea 0870508 y en la Patente de Estados Unidos 5948410, que implica un tratamiento en dos etapas, usando en primer lugar una DNasa (por ejemplo, Benzonasa) y después un detergente catiónico (por ejemplo BCTA).

Los esfuerzos actuales para reducir este riesgo se han enfocado en reducir la concentración total de ADN celular residual del huésped. Un objeto de la presente invención es reducir el riesgo eliminado adicionalmente la funcionalidad de cualquier ADN que permanezca en la célula huésped.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos que dan como resultado productos de cultivos celulares mejorados y procesos con impurezas reducidas. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanece asociado con el producto generado en el cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, tal como β-propiolactona (BPL). Este proceso puede usarse para tratar una diversidad de productos de cultivos celulares que incluyen vacunas y proteínas recombinantes.

La divulgación incluye una vacuna que comprende proteínas inmunogénicas derivadas de un virus propagado en cultivo celular, en el que la vacuna carece sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual.

La funcionalidad de cualquier ADN celular residual del huésped puede eliminarse tratando el ADN con un agente alquilante que escinde el ADN en partes lo suficientemente pequeñas para que no pueda codificar una proteína funcional, se trasponga en un cromosoma humano receptor o de otra manera la maquinaria de replicación del ADN del receptor lo reconozca. Preferentemente, la longitud del ADN de cultivo celular residual degradado es menor de 500 pares de bases. Más preferentemente, la longitud del ADN de cultivo residual degradado es menor de 200 pares de bases.

Descripción detallada

Los procedimientos de la presente invención proporcionan productos y procesos de cultivo celular mejorados con impurezas reducidas. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanezca asociado con el producto generado en el cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, tal como β-propiolactona (BPL). Este proceso puede usarse para tratar diversos productos de cultivo celular que incluyen vacunas.

La divulgación incluye una vacuna que comprende propiedades inmunogénicas derivadas de un virus propagado en un cultivo celular, en el que la vacuna carece sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual.

La funcionalidad de cualquier ADN residual de la célula huésped puede eliminarse por tratamiento del ADN con un agente alquilante que escinde el ADN en partes lo suficientemente pequeñas para que no pueda codificar una proteína funcional, se trasponga en un cromosoma humano receptor o de otra manera la maquinaria de replicación del ADN del receptor lo reconozca. La longitud del ADN de cultivo celular residual degradado (no funcional) es preferentemente menor de 1000 pares de bases (por ejemplo menor de 1000, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 pares de bases). Preferentemente, la longitud del ADN de cultivo celular residual degradado es menor de 500 pares de bases. Más preferentemente, la longitud del ADN de cultivo celular residual degradado es menor de 200 pares de bases.

Como se usa en el presente documento, la alusión "ADN funcional" o "ARN funcional" indica una secuencia de nucleótidos que puede traducirse en una proteína funcional o transponerse en un cromosoma de mamífero. Generalmente, las secuencias de nucleótidos que pueden traducirse en una proteína funcional requiere regiones promotoras, codones de inicio, codones de terminación y secuencias codificantes internas para proteínas funcionales. Cuando se produce lesión del ADN, como a partir de la adición de un agente alquilante, muchas de estas regiones se modifican o se destruyen, de manera que la traducción puede continuar durante más tiempo o continuar solo para formar una subunidad oligopeptídica de la proteína deseada.

El "ADN de cultivo celular funcional residual degradado" se refiere a un ADN funcional que no puede traducirse en una proteína funcional o transponerse en un cromosoma de mamífero. Preferentemente, "el ADN funcional residual degradado" tiene una longitud menor de 1000 pares de bases, más preferentemente menor de 500 pares de bases, incluso más preferentemente menor de 250 pares de bases y más preferentemente menor de 100 pares de bases. La longitud del ADN funcional residual degradado puede determinarse por técnicas convencionales, que incluyen electroforesis en gel.

Los procedimientos de la presente invención permiten composiciones de vacunas que carecen sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual. Como se usa en el presente documento, carecer sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual se refiere a una composición en la que los fragmentos de ADN residual de menos de 200 pares de bases pueden detectarse en menos de 10 ng por 0,5 ml. El tamaño de cualquier ADN de cultivo celular residual puede medirse por técnicas convencionales, incluyendo electroforesis en gel con capilar y tecnología de amplificación de ácidos nucleicos.

El uso de un agente alquilante tal como BPL en la presente invención proporciona la ventaja adicional de reducir la agregación de contaminantes. Las formulaciones de vacunas con menos agregados también pueden tener inmunogenicidad mejorada. La inmunogenicidad de una vacuna se basa en la especificidad de los anticuerpos por epítopes virales particulares. Si la superficie de una proteína está unida o tapada por moléculas desconocidas u ocultas por... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de una vacuna contra el virus de la gripe formulada en una forma subviriónica que comprende proteínas inmunogénicas derivadas de un virus de la gripe propagado en un cultivo celular que comprende:

(i) añadir un agente alquilante para degradar el ADN de cultivo celular funcional residual y también inactivar el virus.

(ii) modificar o fragmentar el virus completo con una concentración modificadora de un agente de fragmentación; y

(iii) aislar las proteínas inmunogénicas

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho agente alquilante es β-propilactona (BPL)

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho ADN de cultivo celular se degrada por tratamiento con menos del 0,1% de β-propilactona (BPL).

4. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la vacuna resultante presenta un nivel de agregación reducido.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en que la etapa (iii) implica separar el ADN de viriones.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el cultivo celular se selecciona de un grupo que consiste en células MDCK, células Vero y células PER.C6.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de fragmentación es un tensioactivo no iónico o iónico.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que el agente de fragmentación en la etapa (iii) es bromuro de cetil trimetil amonio (BCTA).

9. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la vacuna subviriónica es una vacuna fragmentada.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la vacuna subviriónica es una vacuna a base de proteína viral purificada.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior en el que las proteínas inmunogénicas son antígenos virales seleccionados del grupo que consiste en hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteína (NP), proteína de matriz (N1), proteína de membrana (M2), uno o más de los componentes de la transcriptasa (PB1, PB2 y PA).

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que la proteína inmunogénica es hemaglutinina (HA).

13. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que la proteína inmunogénica es neuraminidasa (NA).

14. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente la etapa que consiste en formular las proteínas inmunogénicas en una vacuna.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que comprende:

(i) propagación de virus en un cultivo celular.

(ii) añadir un agente alquilante para degradar el ADN de cultivo celular funcional residual y también para inactivar los virus.

(iii) modificar o fragmentar el virus completo con una concentración modificadora de un agente de fragmentación;

(iv) aislar las proteínas virales; y

(v) formular las proteínas virales en una vacuna en forma de una o más proteínas virales purificadas.

16. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que comprende las etapas de:

(i) propagación de virus en células MDCK en suspensión;

(ii) clarificar el medio de cultivo para proporcionar viriones;

(iii) someter los viriones obtenidos en la etapa (ii) a cromatografía y a ultrafiltración/diafiltración;

(iv) inactivar los viriones con β-propiolactona;

(v) fragmentar los viriones con bromuro de cetil trimetil amonio (BCTA); y

(vi) formular los viriones fragmentados en una vacuna.