PROCEDIMIENTO PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS DE LA GRIPE EN CULTIVO CELULAR Y LOS VIRUS DE LA GRIPE QUE PUEDEN OBTENERSE POR EL PROCEDIMIENTO.

Un procedimiento para preparar una vacuna para administración a seres humanos o animales que comprende:

a) replicación de virus de la gripe en cultivo celular, en el que se cultivan células MDCK que pueden infectarse por virus de la gripe en cultivo celular, las células se infectan con virus de la gripe y después de la infección se cultivan a una temperatura de 33 ºC para replicación del virus, en la que se añade una proteasa a las células cultivadas antes, durante o después de la infección con virus de la gripe; b) recogida y aislamiento de los virus de la gripe replicados de 2 a 10 días después de la infección, incluyendo una etapa de separar células o restos celulares del medio de cultivo; y c) formulación de los virus de la gripe replicados para proporcionar la vacuna.

La presente invención se refiere a procedimientos para preparar una vacuna para administración a seres humanos o animales en cultivo de células MDCK a temperaturas reducidas.

Mancini y col. (Rev. Farm. Bloquím. Univ. São Paulo, Vol. 29(2) 1993; 89-95) desvela experimentos en los que se evaluó la diferencia de tripsina en la multiplicación de virus de la gripe en células MDCK. En estos experimentos las células se incubaron a 35 ºC después de que se añadiera el virus de la gripe.

Todas las vacunas de la gripe que se han usado desde los años 40 hasta la actualidad como vacunas permitidas para el tratamiento de seres humanos y animales consisten en una o más cepas del virus que se han replicado en huevos de gallina embrionados. Estos virus se aislaron del fluido alantoideo de huevos de gallina infectados y se usan sus antígenos como vacuna como partículas del virus intactas o como partículas del virus disgregadas por detergentes y/o disolventes, denominada vacuna escindida, o como proteínas del virus definidas aisladas, denominada vacuna de subunidad. En todas las vacunas permitidas, los virus se inactivan por procedimientos conocidos por el experto en la materia. Incluso la replicación de virus atenuados vivos, que se ensaya en vacunas experimentales, se lleva a cabo en huevos de gallina embrionados.

El uso de huevos de gallina embrionados para producción de vacunas es costoso, laborioso y consume tiempo. Los huevos, de poblaciones sanas de gallinas controladas por veterinarios, deben incubarse antes de la infección, habitualmente durante 12 días. Antes de la infección, los huevos tienen que seleccionarse con respecto a embriones vivos, puesto que solo estos huevos son adecuados para replicación del virus. Después de la infección los huevos se incuban de nuevo, habitualmente durante 2 a 3 días. Los embriones aun vivos en este momento se sacrifican por frío y el fluido alantoideo se obtiene después a partir de los huevos individuales por aspiración. Por medio de procedimientos de purificación laboriosos, se separan sustancias del huevo de la gallina que conducen a efectos secundarios no deseados de los virus y se concentran los virus. Puesto que los huevos no son estériles (sin patógenos), es necesario adicionalmente retirar y/o inactivar pirógenos y todos los patógenos que posiblemente están presentes. Para aumentar la producción de virus, la replicación de los virus de la gripe en los huevos de gallina como norma se lleva a cabo a temperaturas reducidas (aproximadamente 34 ºC). Incluso los virus que provocan enfermedades respiratorias pueden replicarse en cultivo celular. Aquí también, en algunos casos, se emplean temperaturas reducidas (aproximadamente de 33 ºC), que, sin embargo, no tienen efecto en la calidad de una vacuna que pueda obtenerse, sino que favorecen únicamente la replicación.

Pueden replicarse virus de otras vacunas tales como, por ejemplo, virus de la rabia, virus de las paperas, sarampión y rubéola, virus de la polio y virus de FSME en cultivos celulares. Puesto que los cultivos celulares que se originan de bancos celulares ensayados están sin patógenos y, a diferencia de los huevos de gallina, son un sistema de replicación de virus definido que (teóricamente) está disponible en cantidades casi ilimitadas, hacen posible una replicación de virus económica en ciertas circunstancias incluso en el caso de virus de la gripe. La producción de vacuna económica se consigue también posiblemente en tanto que el aislamiento y purificación del virus de un medio de cultivo celular estéril definido parece más sencilla que del fluido alantoideo que contiene proteína en gran medida.

El aislamiento y replicación de virus de la gripe en huevos conduce a una selección de ciertos fenotipos, la mayoría de los cuales difiere del aislado clínico. A diferencia de esto está el aislamiento y replicación de los virus en cultivo celular, en el que no se produce selección dependiente de pase (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1991), 185 189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047 -2051). Para una vacuna eficaz, por lo tanto, la realización de virus en cultivo tisular también va a preferirse a partir de este aspecto que de huevos. Se sabe que los virus de la gripe pueden replicarse en cultivos celulares. Además de células embrionarias de gallinas y células de hámster (BHK 21-F y HKCC), células MDBK y en particular células MDCK se han descrito como células adecuadas para la replicación in Vitro de virus de la gripe (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas 89 -110, Plenum Medical Book Company-Nueva York y Londres, 1987). Un prerrequisito para una infección exitosa es la adición de proteasas al medio de infección, preferentemente tripsina o serina proteasa similares, puesto que estas proteasas escinden extracelularmente la proteína precursora de hemaglutinina [HA0] a hemaglutinina activa [HA1 y HA2]. Solamente la hemaglutinina escindida conduce a la adsorción de los virus de la gripe en células con asimilación de virus posterior en la célula (Tobita, K. y col., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9 -14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1975) 440 -454; Klenk, H. D. y col,. Virology 68 (1975) 426 -439) y de este modo a un ciclo de replicación adicional del virus en el cultivo celular.

La Patente US 4 500 513 describe la replicación de virus de la gripe en cultivos celulares en células que crecen de forma adherente. Después de la proliferación celular, el medio nutriente se retira y se añade medio nutriente fresco a las células, teniendo lugar la infección de las células con virus de la gripe simultáneamente o poco después. Un tiempo dado después de la infección, se añade proteasa (por ejemplo tripsina) para obtener una replicación de virus óptima. Los virus se recogen, purifican y procesan para proporcionar vacuna inactivada o atenuada. La replicación de virus de la gripe económica como un prerrequisito para la producción de vacunas no puede conseguirse, sin embargo, usando la metodología descrita en la patente mencionada, puesto que el cambio de medio, la infección posterior así como la adicción de tripsina que se lleva a cabo más tarde, necesitan que se abran los recipientes de cultivo celular individuales varias veces y es por lo tanto muy laboriosa. Además, aumenta el peligro de contaminación del cultivo celular por microorganismos no deseables y virus con cada manipulación de los recipientes de cultivo. Una alternativa más rentable es proliferación celular en sistemas fermentadores conocidos por el experto en la materia, creciendo las células de forma adherente en micro vehículos. El suero necesario para el crecimiento de las células en los micro vehículos (habitualmente suero de ternero fetal), sin embargo, contiene inhibidores de tripsina, de modo que incluso en este procedimiento de producción es necesario un cambio de medio a medio sin suero para conseguir la escisión de la hemaglutinina de la gripe por tripsina y por lo tanto una replicación de virus adecuadamente alta. De este modo esta metodología también requiere la apertura de los recipientes de cultivo varias veces y por lo tanto trae consigo el aumento de peligro de contaminación.

La presente invención se basa por lo tanto en el objeto de realizar procedimientos disponibles que hagan posible una aplicación de virus de la gripe simple y económica en cultivo celular y conduzca a una vacuna altamente eficaz.

Este objeto se consigue por la provisión de las realizaciones indicadas en las reivindicaciones de la patente.

Se ha descubierto sorprendentemente que por la replicación de los virus de la gripe en células infectadas a temperaturas reducidas, se obtienen virus que tienen una eficacia sensiblemente superior como vacuna que los virus que se obtienen por replicación a 37 ºC. La replicación a 37 ºC, la temperatura usada habitualmente para la replicación de gripe en el cultivo celular, ciertamente conduce a rendimientos de virus comparativamente altos en un tiempo corto. Sin embargo, los virus introducidos de este modo tienen una eficacia baja como vacuna en comparación con virus que se preparan por el procedimiento de acuerdo con la invención.

En el contexto de la presente invención, se estableció una línea celular adicional a partir de la línea celular de riñón canina MDCK, adaptándose dicha línea celular adicional a crecimiento en suspensión en medio sin suero y hace posible por lo tanto una replicación de virus y cultivo eficaz y particularmente simple. Esta línea celular, MDCK 33016, se usa preferentemente particularmente en el procedimiento de acuerdo con la invención. Se depositó... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una vacuna para administración a seres humanos o animales que comprende:

a) replicación de virus de la gripe en cultivo celular, en el que se cultivan células MDCK que pueden infectarse por virus de la gripe en cultivo celular, las células se infectan con virus de la gripe y después de la infección se cultivan a una temperatura de 33 ºC para replicación del virus, en la que se añade una proteasa a las células cultivadas antes, durante o después de la infección con virus de la gripe; b) recogida y aislamiento de los virus de la gripe replicados de 2 a 10 días después de la infección, incluyendo una etapa de separar células o restos celulares del medio de cultivo; y c) formulación de los virus de la gripe replicados para proporcionar la vacuna.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la separación de células o restos celulares del medio de cultivo se lleva a cabo por separadores o filtros.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la etapa b) incluye adicionalmente una etapa de concentración de los virus de la gripe presentes en el medio de cultivo.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración de los virus de la gripe presentes en el medio de cultivo se lleva a cabo por centrifugación de gradiente, filtración o precipitación.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células en la etapa a) se cultivan en suspensión en medio sin suero.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la posibilidad de infección de los virus de la gripe replicados se destruye por medio de detergente o formaldehído.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células MDCK son de la línea celular MDCK 33016 (depositada con el número de depósito DSM ACC 2219 el 7 de Junio de 1995).

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células que pueden infectarse por virus de la gripe crecen de forma adherente o en suspensión.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la recogida y aislamiento de los virus de la gripe tiene lugar de 2 a 7 días después de la infección.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, estando los virus de la gripe replicados en combinación en la vacuna con sustancias que aumentan la respuesta inmune.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la posibilidad de infección de los virus replicados se destruye por medio de procedimientos químicos y/o físicos.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los virus están presentes en la vacuna como virus atenuados vivos.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proteasa es una serina proteasa.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la serina proteasa es tripsina.