Vacunas virales derivadas de células con niveles reducidos de ADN celular residual.

Una vacuna contra la gripe que comprende proteínas inmunogénicas derivada de un virus de la gripe propagado en cultivo celular,

en donde la mencionada vacuna contiene menos de 20 ng/mL de ADN de cultivo celular residual y la longitud del ADN de cultivo celular residual es menor de 200 pares de bases

CAMPO TÉCNICO

La invención proporciona vacunas contra la gripe mejoradas con impurezas reducidas. La divulgación proporciona un procedimiento mejorado para degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanece asociado con el producto generado en el cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, tal como p-propiolactona (BPL).

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La producción comercial de vacunas virales requiere típicamente grandes cantidades de virus como fuente de antígeno. Las cantidades comerciales de virus para la producción de vacunas pueden conseguirse por cultivo y replicación de un virus de semilla en un sistema de cultivo celular. Los sistemas de cultivo celulares adecuados para la replicación viral incluyen células de mamíferos, de aves o de insectos, prefiriéndose particularmente los sistemas de cultivo celulares de mamíferos para las vacunas virales para garantizar la correcta glucosilación y plegamiento de las proteínas antigénicas virales. Por similares razones, también se prefieren los sistemas de cultivo celulares de mamíferos para la expresión de proteínas recombinantes.

Si no se modifican de su estado de origen natural, los cultivos celulares tienen una capacidad limitada para reproducirse y por consiguiente son poco prácticos e ineficaces para producir la cantidad de material necesario para una vacuna o proteína recombinante comercial. Por consiguiente, con fines de fabricación, se prefiere que las células se modifiquen para ser líneas celulares "continuas" o "inmortalizadas" para aumentar el número de veces que pueden dividirse. Muchas de estas modificaciones emplean mecanismos similares a los que están implicados en células oncogénicas. Como tal, existe una preocupación de que cualquier material residual de los procesos de cultivo celular, tal como ADN celular del huésped, pueda eliminarse de la formulación final de un producto de vacuna o de proteína recombinante fabricado en estos sistemas.

Un modo convencional para eliminar ADN celular residual del huésped es por tratamiento con DNasa. Un procedimiento conveniente de este tipo se desvela en la Patente Europea 0870508 y en la Patente de Estados Unidos 594841 O, que Implica un tratamiento en dos etapas, usando en primer lugar una DNasa (por ejemplo, Benzonasa) y después un detergente catiónlco (por ejemplo BCTA).

Los esfuerzos actuales para reducir este riesgo se han enfocado en reducir la concentración total de ADN celular residual del huésped. Un objeto de la presente Invención es reducir el riesgo eliminado adicionalmente la funcionalidad de cualquier ADN que permanezca en la célula huésped.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente Invención proporciona procedimientos que dan como resultado productos de cultivos celulares mejorados y procesos con Impurezas reducidas. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanece asociado con el producto generado en el cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, tal como (3-propiolactona (BPL).

La invención Incluye una vacuna que comprende proteínas inmunogénicas derivadas de un virus propagado en cultivo celular como se define en las reivindicaciones, en el que la vacuna carece sustanclalmente de ADN de cultivo celular funcional residual. Además, la divulgación se refiere a proteínas recombinantes expresadas en cultivo celular, donde la formulación de proteínas recomblnantes final está sustancialmente libre de ADN de cultivo celular funcional residual.

La funcionalidad de cualquier ADN celular residual del huésped puede eliminarse tratando el ADN con un agente alquilante que escinde el ADN en partes lo suficientemente pequeñas para que no pueda codificar una proteína funcional, se trasponga en un cromosoma humano receptor o de otra manera la maquinaria de replicación del ADN del receptor lo reconozca. Preferentemente, la longitud del ADN de cultivo celular residual degradado es menor de 500 pares de bases. Más preferentemente, la longitud del ADN de cultivo residual degradado es menor de 200 pares de bases.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La Invención proporciona vacunas contra la gripe mejoradas con impurezas reducidas. La divulgación proporciona un método mejorado de degradar cualquier ADN de cultivo celular funcional residual que permanece

asociado con el producto generado del cultivo celular. De acuerdo con la invención, el ADN de cultivo celular funcional residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante de ADN, como p-propiolactona (BPL).

La invención incluye una vacuna contra la gripe que comprende proteínas inmunogénicas derivadas de un virus propagado en cultivo celular como se define en las reivindicaciones, en donde la vacuna está sustancialmente libre de ADN de cultivo celular funcional residual.

La funcionalidad de cualquier ADN de células huésped residual puede eliminarse por el tratamiento del ADN con un agente alquilante que escinde el ADN en porciones lo suficientemente pequeñas para que no sea posible codificar para una proteína funcional, sea transpuesto en un cromosoma del recipiente humano, o sea reconocido de otra manera por la maquinaria de replicación de ADN del recipiente. La longitud del ADN de cultivo residual degradado (no funcional) es menor de 200 pares de bases.

Como se usa en el presente documento, la alusión "ADN funcional" o "ARN funcional" indica una secuencia de nucleótidos que puede traducirse en una proteína funcional o transponerse en un cromosoma de mamífero. Generalmente, las secuencias de nucleótidos que pueden traducirse en una proteína funcional requiere regiones promotoras, codones de inicio, codones de terminación y secuencias codificantes internas para proteínas funcionales. Cuando se produce lesión del ADN, como a partir de la adición de un agente alquilante, muchas de estas regiones se modifican o se destruyen, de manera que la traducción puede continuar durante más tiempo o continuar solo para formar una subunidad oligopeptídica de la proteína deseada.

El "ADN de cultivo celular funcional residual degradado" se refiere a un ADN funcional que no puede traducirse en una proteína funcional o transponerse en un cromosoma de mamífero. Preferentemente, "el ADN funcional residual degradado" tiene una longitud menor de 1000 pares de bases, más preferentemente menor de 500 pares de bases, incluso más preferentemente menor de 250 pares de bases y más preferentemente menor de 100 pares de bases. La longitud del ADN funcional residual degradado puede determinarse por técnicas convencionales, que incluyen electroforesis en gel.

La invención proporciona composiciones de vacunas que carecen sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual. Como se usa en el presente documento, carecer sustancialmente de ADN de cultivo celular funcional residual se refiere a una composición en la que los fragmentos de ADN residual de menos de 200 pares de bases pueden detectarse en menos de 10 ng por 0,5 mi. El tamaño de cualquier ADN de cultivo celular residual puede medirse por técnicas convencionales, incluyendo electroforesis en gel con capilar y tecnología de amplificación de ácidos nucleicos.

El uso de un agente alquilante tal como BPL en la presente invención proporciona la ventaja adicional de reducir la agregación de contaminantes. Las formulaciones de vacunas con menos agregados también pueden tener inmunogenicidad mejorada. La inmunogenicidad de una vacuna se basa en la especificidad de los anticuerpos por epítopes virales particulares. Si la superficie de una proteína está unida o tapada por moléculas desconocidas u ocultas por la agregación en macromoléculas grandes, los epítopes pueden hacerse menos reconocibles y por lo tanto menos eficaces en una vacuna. Además, las formulaciones de vacunas con agregados reducidos pueden tener ventajas de procesamiento adicionales. Los procesos de purificación dependen del aislamiento de la proteína esperada, por ejemplo hemaglutinina y neuraminidasa en una vacuna contra la gripe. Si la proteína se modifica estructuralmente por la presencia de agregados o entrecruzamiento puede no reconocerse y posteriormente eliminarse por cromatografía de columna, filtración o centrifugación.

Agentes alquilantes

Los agentes alquilantes para su uso en la presente invención incluyen sustancias que introducen un radical alquilo en un compuesto. Preferentemente, el agente alquilante es un agente monoalquilante, tal como BPL. La BPL es un agente monoalquilante... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna contra la gripe que comprende proteínas ¡nmunogénicas derivada de un virus de la gripe propagado en cultivo celular, en donde la mencionada vacuna contiene menos de 20 ng/mL de ADN de cultivo celular residual y la longitud del ADN de cultivo celular residual es menor de 200 pares de bases.

2. La vacuna de la reivindicaciónl, en donde cualquier ADN de cultivo celular residual se degrada por tratamiento con un agente alquilante.

3. La vacuna de la reivindicación 2, en donde el agente alquilante se usó como el agente inactivante para el virus usado en la vacuna.

4. La vacuna de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el mencionado agente alquilante es p- propiolactona (BPL), por ejemplo menos del 0,1% de p-propiolactona (BPL).

5. La vacuna de la reivindicación 4, que contiene menos de un 0,01% de ácido propiónico y p-propiolactona (BPL) combinados.

6. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cultivo celular es seleccionado del grupo consistente de células MDCK, células Vero y células PER.C6.

7. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un adyuvante de emulsión de aceite en agua.

8. La vacuna de la reivindicación 7, en donde el adyuvante de emulsión de aceite en agua tiene gotitas con un diámetro submicrométrico.

9. La vacuna de la reivindicación 8, en donde el adyuvante de emulsión de aceite en agua comprende escualeno, Tween 80 y Span 85.

10. La vacuna de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el adyuvante de emulsión de aceite en agua comprende escualeno, un tocoferol y Tween 80.

11. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la vacuna comprende viriones fragmentados o antígenos de superficie purificados.

12. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tamaño de cualquier ADN de cultivo celular residual se mide por electroforesis en gel con capilar.

13. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la vacuna es una vacuna trivalente.

14. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la vacuna contiene antígenos de una cepa de virus de la gripe.

15. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la vacuna contiene menos de 5 pg/ml de material mercurial.

16. Una vacuna contra la gripe que comprende proteínas ¡nmunogénicas derivadas de un virus de la gripe propagado en cultivo celular, en donde la mencionada vacuna se puede obtener por un proceso que comprende los pasos de:

(i) añadir P-propiolactona (BPL) a viriones purificados para degradar el ADN de cultivo celular funcional residual y también para inactivar el virus.

(ii) modificar o fragmentar el virus completo con una concentración modificadora de cetiltrimetilamoniobromuro (CTAB); y

(iii) aislar las proteínas ¡nmunogénicas