Inhibidores de Smad7 para el tratamiento de enfermedades del SNC.

Un inhibidor específico de la expresión o función de Smad7 para su uso en la prevención,

mejora o tratamiento deesclerosis múltiple o isquemia cerebral, en el que dicho inhibidor específico se selecciona del grupo que consiste enanticuerpos intracelulares o fragmentos de anticuerpos, aptámeros, intrámeros, ARNi y moléculas antisentido anti-Smad7.

Inhibidores de Smad7 para el tratamiento de enfermedades del SNC

La presente invención se refiere a un inhibidor específico de la expresión o función de Smad7 para su uso en la prevención, mejora o tratamiento de esclerosis múltiple o isquemia cerebral, en el que dicho inhibidor específico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos intracelulares o fragmentos de anticuerpos, aptámeros, intrámeros, ARNi (ARN bicatenario) y moléculas antisentido anti-Smad7.

El presente modelo para la iniciación de enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T del SNC incluye activación de linfocitos T específicos para antígeno periféricos y diferenciación de Th1 (Martin, 1992; Miller, 1994; Zamvil, 1990) . Parece que se requiere una etapa de activación de linfocitos T periféricos para que los linfocitos T autorreactivos entren en el SNC por la barrera hematoencefálica (Wekerle, 1986) . El proceso de formación de lesiones está adicionalmente gobernado por un complejo patrón de expresión de cito- y quimiocinas tras la reestimulación de linfocitos T autorreactivos in situ (Hoffman, 1998; Karpus, 1999) . Es ampliamente aceptado que las células Th1, críticas para la inmunidad mediada por células por su producción de IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa y linfotoxina, participan en la inmunopatología de enfermedad autoinmunitaria específica de órgano (Liblau, 1995; Raine, 1995; Steinman, 1997) . Se ha sugerido una función como reguladores para las células Th2 (Mathisen, 1997; Nicholson, 1995; Racke, 1994) y factor de crecimiento transformante productor de células beta (TGF-beta) (Chen, 1996; 1994; O'Garra, 1997; Weiner, 1994) .

El TGF-beta pertenece a una familia de péptidos con efectos pleiotrópicos ampliamente distribuidos por todo el cuerpo (Spom, 1989) y en particular en el sistema inmunitario (Letterio, 1998) . Además de los TGF-beta, las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y la activina representan la superfamilia de BMP (Miyazono, 2001) .

Los tres TGF-beta isotípicos están extremadamente muy conservados a través de especies con una identidad superior al 99% entre las secuencias de TGF-beta 1 maduro de diversas especies de mamífero (Der y nck, 1986; 1987) . Los TGF-beta tienen importantes funciones en el crecimiento y la diferenciación celular, desarrollo de órganos, formación de matrices, reparación de heridas y función inmunitaria (Blobe, 2000; Chen, 2001; Letterio, 2000) .

El TGF-beta regula los procesos celulares uniéndose a tres receptores de la superficie de la célula de alta afinidad conocidos como tipos I, II y III. Los receptores de tipo III son el tipo de receptores más abundantes. Se unen a TFGbeta y lo transfieren a sus receptores de señalización, los receptores de tipo I (RI) y II (RII) . Tras la unión de un ligando a un receptor de tipo II, las cinasas de receptores de tipo II fosforilan residuos de serina y treonina dentro del dominio GS (rico en glicina-serina) intracelular de receptores de tipo I, conduciendo a la activación del receptor de tipo I. Entonces, el RI de TGF-beta activado interactúa con una molécula de adaptador SARA (anclaje Smad para la activación del receptor) (Tsukazaki, 1998) , que facilita el acceso de miembros particulares de la familia Smad de proteínas, llamados Smad regulados por receptor (R-Smad) para receptores de TGF-beta activados. Entonces, las cinasas de receptores de tipo I activadas fosforilan R-Smad diferencialmente en dos residuos de serina en sus extremos C (resumido en Itoh, 2000) . R-Smad incluyen proteínas Smad1, 2, 5 y 8. Smad2 y 3 median en la señalización de TGF-beta y activinas; y Smad8 media en la señalización de cinasas de receptores de ALK-2 (Baker, 1996; Lagna, 1996; Liu, 1996; Zhang, 1996, 1997) .

Los inhibidores de Smad (I-Smads) consisten en Smad6 y Smad7 de vertebrado e hijas de Drosophila contra dpp (Dad) . A diferencia de R-Smad, que aumentan la señalización de moléculas de TGF-beta, I-Smads inhiben la señalización de la superfamilia de TGF-beta. Mientras que Smad6 parece que inhibe preferencialmente la señalización de BMP, Smad7 actúa de inhibidor general de la señalización de la familia de TGF-beta (Itoh, 1998; Souchelnytskyi, 1998; Ishisaki, 1999) . Los I-Smad pueden unirse establemente al dominio intracelular de receptores de tipo I activados, inhibiendo así adicionalmente la transducción de señales previniendo la fosforilación de R-Smad por el receptor (Imamura, 1997; Inoue, 1998; Souchelnytskyi, 1998) .

La expresión de I-Smad parece ser parte de un bucle de retroalimentación negativo. La expresión de Smad6 y 7 puede inducirse rápidamente y en algunos casos directamente por BMP, activina y/o TGF-beta en células cultivadas. Además, Smad3 y 4 pueden unirse directamente al promotor de Smad7 para mediar en la activación de este promotor por activina o TGF-beta. (Nagarajan, 1999; von Gersdorff, 2000) . Además de la estimulación por la ruta de TGF-beta-Smad, la expresión de Smad7 también puede inducirse por IFN-gamma mediante la ruta de Jak/Stat (Ulloa, 1999) , por TNF-alfa mediante la activación de NF-kappaB (Bitzer, 2000) y por norepinefrina también por NFkappaB (Kanamaru, 2001) .

Además de la función de Smad7 como inhibidor de la fosforilación de R-Smad por receptores de tipo 1 en la frontera citoplasma/membrana celular, también se encontró que Smad7 se producía abundantemente en los núcleos de ciertas células y que era exportado del núcleo tras la estimulación de TGF-beta o un cambio en el sustrato celular (Itoh, 1998; Zhu, 1999) . Pulaski (2001) mostró que la mutación en un sitio de fosforilación principal de Smad7 en Ser-249 no afectó el efecto inhibidor de Smad7 sobre la señalización de TGF-beta o BMP7 y no interfirió con la localización nuclear de Smad7. En su lugar, se mostró que la fosforilación de Smad7 en Ser-249 era importante para su capacidad independiente de ligando para regular la transcripción.

Ratones que expresan en exceso Smad7 presentan respuestas de linfocitos T defectuosas para TGF-beta 1, muestran sustancialmente mayor producción de citocinas in vitro y muestran inflamación potenciada de las vías respiratorias inducida por antígeno (Nakao, 2000) . Se ha mostrado que Smad7 se expresa en exceso en enfermedad inflamatoria del intestino (EII) , mucosa y linfocitos T de la mucosa purificados. En un sistema in vitro, oligonucleótidos antisentido específicos para Smad7 redujeron la expresión de proteínas Smad7 en células aisladas de pacientes con EII, permitiendo que las células respondieran a TGF-beta exógeno (Monteleone, 2001) .

El documento WO 97/30065 identifica un ADNc (fchd540) que codifica Smad7 y trata la regulación por incremento de Smad7 en estados de enfermedad cardiovascular. Las enfermedades elegidas como diana mediante los procedimientos descritos en el documento WO 97/30065 se refieren a trastornos cardiovasculares, en particular a arterosclerosis, isquemia/reperfusión, hipertensión, reestenosis e inflamación arterial, además de a trastornos oncogénicos fibroproliferativos que incluyen retinopatía diabética, cáncer, tumorigénesis, vascularización de tumores, angiogénesis, arterosclerosis, inflamación y fibrosis.

El documento WO 98/53068 también describe moléculas de ácidos nucleicos que codifican Smad7 y proporciona procedimientos para disminuir o aumentar la transducción de señales de la superfamilia de TGF-beta en células de mamífero basándose en la elección como diana de genes smad7, productos génicos o componentes de interacción. Además, se describen procedimientos para tratar un sujeto que padece cáncer de pulmón caracterizado por elevada expresión de un gen de Smad6 o un gen de Smad7. Estos procedimientos implican administrar al sujeto una cantidad de un ácido nucleico antisentido que se une al producto de expresión del gen de Smad 6 o Smad7 eficaz para reducir la expresión del gen.

Además, se desvelan procedimientos médicos para reducir defectos oculares en un embrión de mamífero en desarrollo. Estos procedimientos incluyen poner en contacto las células del embrión con un agente que reduce la expresión o actividad de una molécula de ácido nucleico de Smad7 o un producto de expresión de la misma.

El documento WO 01/53313 describe compuestos antisentido, se proporcionan composiciones y procedimientos para modular la expresión de Smad7. La invención describe un procedimiento para tratar un ser humano que tiene una enfermedad o afección asociada a Smad7 que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz del compuesto antisentido de... [Seguir leyendo]

1. Un inhibidor específico de la expresión o función de Smad7 para su uso en la prevención, mejora o tratamiento de esclerosis múltiple o isquemia cerebral, en el que dicho inhibidor específico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos intracelulares o fragmentos de anticuerpos, aptámeros, intrámeros, ARNi y moléculas antisentido anti

Smad7.

2. Uso de un inhibidor específico de la expresión o función de Smad7 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, mejora o tratamiento de esclerosis múltiple o isquemia cerebral, en el que dicho inhibidor específico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos intracelulares o fragmentos de anticuerpos, aptámeros, intrámeros, ARNi y moléculas antisentido anti-Smad7.

3. El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que dicha molécula antisentido anti-Smad7 comprende una molécula de ácido nucleico que es la cadena complementaria de una cadena complementaria invertida de la región codificante de Smad7.

4. El inhibidor para el uso de o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha molécula antisentido anti-Smad7 comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la 15 molécula de ácido nucleico cttcggctgccccacccg, atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gccgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcacagagtcgacta, ggcaaaagccattcccct, gccgatcttgctccgcac, ctccggctgccccacccc, cgaacatgacctccgcac, atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gctgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcgcagagtcggcta, ggcaaaagccattcccct, gccgattttgctccgcac, ctgccccttcttccaaaa, actcacacacactcctga, tgcccaggtactgcctct, gagatccaggagcagatg, cttcggctgccccacccg,

atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gccgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcacagagtcgacta, ggcaaaagccattcccct, gccgatcttgctcctcac y gtcgccccttctcccccgcag.

5. El inhibidor para el uso de o el uso de la reivindicación 1, en el que dicho ARNi es un ARNip.

6. El inhibidor para el uso de o el uso de la reivindicación 5, en el que dicho ARNip se selecciona del grupo que consiste en

ARNi: nt 3-2.

5. GUUCAGGACCAAACGAUCUGC-3', n.

2. .

5. GCAGAUCGUUUGGUCCUGAACAU-3' ARNi2: n.

28. 30.

5. CUCACGCACUCGGUGCUCAAG-3', n.

30. 28.

5. CUUGAGCACCGAGUGCGUGAGCG-3', ARNi3: n.

20. 22.

5. CUCGGCGCCCGACUUCUUCuu-3', n.

22. 20.

5. GAAGAAGUCGGGCGCCGAGUU-3', ARNi4: n.

26. 28.

5. ACGACUUUUCUCCUCGCCUuu-3', n.

28. 26.

5. AGGCGAGGAGAAAAGUCGUUU-3';

ARNi5: n.

31. 32.

5. ACGAUCUGCGCUCGUCCGGuu-3', n.

32. 30.

5. CCGGACGAGCGCAGAUCGUUU-3'; ARNi6: n.

57. 59.

5. GGCGCUCACGCACUCGGUGuu-3', n.

59. 57.

5. CACCGAGUGCGUGAGCGCCUU-3'; ARNi7: n.

60. 62.

5. GGAGCGGCAGCUGGAGCUGuu-3', n.

62. 60.

5. CAGCUCCAGCUGCCGCUCCUU-3',

ARNi8: n.

77. 79.

5. AGUGUUCAGGUGGCCGGAUuu-3', n.

79. 77.

5. AUCCGGCCACCUGAACACUuu-3',

ARNi9: n.

81. 83.

5. GUCAAGAGGCUGUGUUGCUuu-3', n.

83. 81.

5. AGCAACACAGCCUCUUGACUU-3', ARNi10: n.

82. 83.

5. GAGGCUGUGUUGCUGUGAAuu-3', n.

83. 81.

5. UUCACAGACACACAGCCUCUU-3',

ARNi11: n.

83. 85.

5. UCUUACGGGAAGAUCAACCuu-3', n.

85. 83.

5. GGUUGAUCUUCCCGUAAGAUU-3', ARNi12: n.

85. 86.

5. GAUCAACCCCGAGCUGGUGuu-3',

n.

86. 84.

5. CACCAGCUCGGGGUUGAUCUU-3', ARNi13: n.

85. 87.

5. CCCCGAGCUGGUGUGCUGCuu-3', n.

87. 85.

5. GCAGCACACCAGCUCGGGGUU-3',

ARNi14: n.

100. 102.

5. CGAAUUAUCUGGCCCCUGGuu-3', nt 1026-100.

5. CCAGGGGCCAGAUAAUUCGUU-3', ARNi15: nt 1046-106.

5. CUUCUUCUGGAGCCUGGGGuu-3', nt 1064-104.

5. CCCCAGGCUCCAGAAGAAGUU-3', ARNi16: nt 1177-119.

5. UGGCUUUUGCCUCGGACAGuu-3', nt 1195-117.

5. CUGUCCGAGGCAAAAGCCAUU-3',

(continuación)

ARNi17: nt 1201-121.

5. UUCGGACAACAAGAGUCAGuu-3', nt 1219-119.

5. CUGACUCUUGUUGUCCGAAUU-3', ARNi18: nt 1297-131.

5. CCGCAGCAGUUACCCCAUCuu-3', nt 1315-129.

5. GAUGGGGUAACUGCUGCGGUU-3', ARNi19: nt 1324-134.

5. GUCCGCCACACUGGACAACuu-3', nt 1342-132.

5. GUUGUCCAGUGUGGCGGACUU-3', ARNi20: nt 1342-136.

5. CCCGGACUCCAGGACGCUGuu-3', nt 1360-134.

5. CAGCGUCCUGGAGUCCGGGUU-3',

7. El inhibidor para el uso de o el uso de la reivindicación 1, en el que dicha esclerosis múltiple es esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva crónica primaria, neuromielitis óptica o esclerosis múltiple fulminante.

8. El inhibidor para el uso de o el uso de la reivindicación 1, en el que dicha isquemia cerebral es isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global o lesión cerebral isquémica hipóxica.