Inhibidores de la división de células tumorales.

La presente invención se refiere a nuevos inhibidores de la división de células tumorales.

Dichos inhibidores, son derivados semisintéticos de la neurostatina. Además en la presente invención se describe un nuevo procedimiento de síntesis de los inhibidores y de la neurostatina. Además se describe el uso de estos inhibidores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores cerebrales.

Inhibidores de la división de células tumorales La presente invención se refiere a nuevos inhibidores de la división de células tumorales. Dichos inhibidores, son derivados semisintéticos de la neurostatina. Además la presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de síntesis de los inhibidores y de la neurostatina. Además se refiere al uso de estos inhibidores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores cerebrales. La invención se encuadra en el sector farmacéutico y es aplicable en el sector médico para el tratamiento de tumores cerebrales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El glioblastoma multiforme es el tumor cerebral primario más frecuente en adultos y también el más mortal. En Estados Unidos, solo la mitad de los pacientes que reciben el tratamiento estándar sobreviven un año después del diagnóstico. Menos de uno de cada diez sobrevive más de cinco años. Suele presentarse en personas mayores de cuarenta años, con un máximo de incidencia entre los 50 y 55 años y es más frecuente entre los varones. En adultos, hay unos 17.000 nuevos casos de tumores cerebrales cada año (además, otros tipos de cáncer pueden metastatizar al cerebro) , lo que supone unas 14000 muertes. Los tumores cerebrales son la primera causa de muerte por cáncer en niños y menores de 20 años.

El tratamiento depende de la localización y del grado del tumor; se aplica cirugía cuando el tumor es accesible y no hay peligro de dañar estructuras vitales. La radioterapia se utiliza para detener el crecimiento del tumor o para hacer que disminuya de tamaño y la quimioterapia destruye las células tumorales que quedan después de la cirugía y la radioterapia. La quimioterapia más habitual (BCNU, CCNU) no parece tener un efecto significativo, aunque en algunas ocasiones se ha conseguido aumentar algunos meses la supervivencia. Por tanto, el desarrollo de nuevas moléculas capaces de detener la proliferación de gliomas es de gran interés para el tratamiento de esta enfermedad.

Los gangliósidos, son glicolípidos formados por una cadena de ceramida (que se compone de un residuo del aminoalcohol esfingosina unido a un ácido graso) unida a una cadena de oligosacárido. Los gangliósidos tienen como característica estructural, la presencia de uno o varios residuos de ácido siálico en la cadena de oligosacárido. La Neurostatina se caracteriza por ser un gangliósido de la serie b, GD1b, con una modificación en forma de O-acetilación en uno de los hidroxilos de su siálico terminal (Romero-Ramirez L, Nieto-Sampedro M. Inhibiting human astrocytoma growth: structure-activity relationships in neurostatin related glycolipids. Journal of Medicinal Chemistr y 2004;47 (21) :4983-4.) . La posición de esta O-acetilación es preferentemente en el hidroxilo del carbono 9, ya que aunque también han sido descritas O-acetilaciónes en los carbonos 7 y 8, en condiciones de pH fisiológico los Oacetilos en esos carbonos migran a la posición 9.

La Neurostatina es un gangliósido natural que se expresa en concentración muy baja en el sistema nervioso central de los mamíferos (Abad-Rodriguez J, Bernabe M, Romero-Ramirez L, Vallejo-Cremades M, Fernandez-Mayoralas A, Nieto-Sampedro M. Purification and structure of neurostatin, an inhibitor of astrocyte division of mammalian brain. Journal of Neurochemistr y 2000;74 (6) :2547-56.) . El procedimiento de purificación de la neurostatina a partir de cerebros de mamífero es muy laborioso y el rendimiento obtenido hace inviable su uso, tanto en experimentación animal como en clínica.

Recientemente, se han desarrollado una serie de procedimientos para la obtención de gangliósidos O-acetilados mediante diferentes métodos de O-acetilación del gangliósido comercial GD1b (Valle-Argos B, Gomez-Nicola D, Nieto-Sampedro M. Synthesis and characterization of neurostatin-related compounds with high inhibitor y activity of glioma growth. European Journal of Medicinal Chemistr y ;2010, 45 (5) :2034-43.) . Aunque los procedimientos químicos reducen los pasos para la obtención de gangliósidos O-acetilados, son reacciones inespecíficas donde no se controlan ni el número, ni la posición de las O-acetilaciones. En consecuencia, se obtiene una gran variedad de productos que dificultan su purificación a homogeneidad y reducen considerablemente el rendimiento de la reacción. A pesar de que este procedimiento reduce los pasos necesarios para producir neurostatina, el producto obtenido sigue siendo insuficiente para su posible uso clínico.

Por otro lado el procedimiento descrito en la publicación (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. Identification of a sialate O-acetyltransferase from Campylobacter jejuni: demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminalalpha-2, 8linked sialic acid. The Journal of Biological Chemistr y 2006;281 (17) :11480-6) consigue O-acetilar polisacáridos de glicolípidos derivados del éster del ácido hexanoico 6- (5-Fluorescein-carboxamido) - (FCHASE) y glicoproteínas, pero no gangliósidos.

El procedimiento descrito en la patente (WO 2007016792) es bastante general. Los rangos de pH que describe son bastante amplios (de 5 a 8) , habla de un donador de grupos acetilo y un aceptor de los grupos acetilo, donde se prevé el uso de sustancias tampón y la reacción se lleva a cabo entre 0 y 40 ºC, preferentemente entre 20 y 37 ºC, en medio acuoso. También describe que la mezcla de reacción puede contener cationes metálicos divalentes (tales como magnesio o manganeso) y también puede contener detergentes solubilizantes o disolventes orgánicos, si fuese necesario. Este procedimiento no detalla ningún protocolo específico para O-acetilar gangliósidos y siguiéndolo no se consigue O-acetilar gangliósidos.

En el procedimiento descrito por Houliston, R. et al. (Houliston RS, Endtz HP, Yuki N, et al. Identification of a sialate Oacetyltransferase from Campylobacter jejuni: demonstration of direct transfer to the C-9 position of terminalalpha-2, 8linked sialic acid. The Journal of Biological Chemistr y 2006;281 (17) :11480-6) que utiliza una O-acetiltransferasa de la bacteria Campylobacter jejuni. Este procedimiento fue utilizado para O-acetilar específicamente los ácidos siálicos terminales de las cadenas de polisacaridos de glicolípidos derivados del éster succidimil del ácido hexanoico 6- (5Fluorescein-carboxamido) (FCHASE) y también glicoproteínas. El uso de este enzima para O-acetilar oligosacáridos se encuentra patentado (WO 2007016792 20070215) .

El procedimiento descrito por estos investigadores no pudo O-acetilar con éxito gangliósidos. Los gangliosidos en solución acuosa se agrupan en micelas que impiden el acceso de la O-acetiltransferase al siálico terminal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una nueva serie de gangliósidos con actividad inhibidora (de la familia de la neurostatina) de la división de células tumorales y del crecimiento de gliomas. Además la presente invención describe un novedoso procedimiento de obtención de gangliósidos y de la neurostatina que se caracteriza por su sencillez, especificidad y alto rendimiento.

Utilizando el mismo procedimiento que se describe hemos obtenido nuevos gangliósidos de la familia de la neurostatina O-propionilados, no descritos en la naturaleza y que tienen mayor actividad inhibidora de la proliferación de la línea de glioma C6 (Tabla 1) . Estos compuestos podrían ser más resistentes a la hidrólisis por glicosidasas, por lo que su efecto sería más duradero.

Por lo tanto, estos gangliósidos O-propionilados son unos productos muy interesantes para su uso clínico como antitumorales.

Teniendo en cuenta la gravedad de los glioblastomas y la escasa efectividad de los tratamientos disponibles, el desarrollo de nuevas moléculas capaces de detener la proliferación de gliomas es de enorme interés.

Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a un gangliósido de fórmula general (I) :

OH

Y

X1

HO

X3

(I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde; Y es una ceramida; Ac es un grupo acetilo; X1 es un grupo -CH2-O-CO-X2 X2 es un grupo alquilo C1-C2;

X3 se selecciona entre H, OH, un compuesto de fórmula general (II) o un compuesto de fórmula general (III)

AcHN O X4O OH AcHN O

HO O

HO

O O

O HO O

H... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula general (I) :

OY

OHX1

O

HO

(I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde; Y es una ceramida, Ac es un grupo acetilo; X1 es un grupo -CH2-O-CO-X2;

X2 es un grupo alquilo C1-C2; X3 se selecciona entre H, OH, un compuesto de fórmula general (II) o un compuesto de fórmula general (III)

X4O OH AcHN OH

AcHN O

HO OHO

O O

O HO O

H HO

HO OH

(II) (III)

donde X4 se selecciona entre H o un compuesto de fórmula general (IV) :

(IV)

donde: X5 se selecciona entre un grupo OH o un grupo -O-COX6; y X6 es un grupo alquilo C1-C2;

excepto cuando:

- X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, X3 es el compuesto de fórmula general (III) y X4 es hidrógeno;

- X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, y X3 es el compuesto (II) ; y

- X1 es -CH2-O-CO-X2, X2 es metilo, X3 es el compuesto de fórmula general (III) donde X4 es el compuesto de fórmula general (IV) donde X5 es OH.

2. El compuesto según la reivindicación 1, donde Y es una ceramida que comprende una esfingosina y un ácido graso natural o sintético.

3. El compuesto según la reivindicación 2, donde la esfingosina comprende de 18 a 20 átomos de carbono y de 0 a 2 insaturaciones.

4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, donde el ácido graso comprende de 8 a 24 átomos de 15 carbono y con un número de insaturaciones de 0 a 4.

5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde X2 es un grupo metilo.

6. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde X2 es un grupo etilo.

7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde X3 es H.

8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde X3 es OH.

9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde X3 es un grupo de fórmula (II) .

10. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde X3 es un grupo de fórmula (III) .

11. El compuesto según la reivindicación 10, donde X4 es H.

12. El compuesto según la reivindicación 10, donde X4 es un compuesto de fórmula general (IV) .

13. El compuesto según la reivindicación 12, donde X5 es un grupo OH. 25 14. El compuesto según la reivindicación 12, donde X5 es un grupo -O-COX6.

15. El compuesto según la reivindicación 14, donde X6 es un metilo.

16. El compuesto según la reivindicación 1, que se selecciona de la siguiente lista:

O H3C

C

HOCH2 O COOH HO O OAcHN

COOH

HO HO

OH OH OHO

OO O

OHOAcHN O

Y

OHHO

OH OH O-propionil-GD3

O-propionil-GD2

O HO H3C

C O COOH

CH2 HO

O OAcHN

COOH HO HO

OH OH OHO OO

OOAcHN

HOO

Y

OHHO OHNHAc

OH HO

O

O O

O HO

HOOH OH

O-propionil-GD1b

O

di-O-acetil-GT1b

O CH3 CHO

CH2 O

OH OOO

HO

Y

HO OH HO

HO AcHN HO

HOOH OH

O-propionil-GT1b

donde Y es una ceramida.

17. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para su uso como medicamento.

18. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

19. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, donde además comprende otro principio activo. 10 20. Procedimiento de síntesis de un compuesto de fórmula general (I) :

OH (I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde; Y, Ac, X1, X2, X3, X4, X5 y X6 se definen como en la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) disolver un gangliósido en una solución tampón; b) adicionar un emulgente a la mezcla de la etapa a) ; c) adicionar a la mezcla de la etapa b) la enzima o-acetiltransferasa; y d) parar la reacción por adición de metanol a la mezcla obtenida en la etapa c) .

21. El procedimiento según la reivindicación 20, donde en la etapa a) el gangliósido se selecciona del grupo formado por GD1b, GD3, GD2 o GT1b.

22. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, donde en la etapa a) se añade una cantidad de gangliósido entre 50 a 600 IM.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, donde en la etapa a) se añade una cantidad de gangliósido entre 300 y 600 IM.

24. El procedimiento según la reivindicación 23, donde en la etapa a) se añade una cantidad de gangliósido de 500 IM.

25. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde la solución tampón está en una concentración desde 1 hasta 250 mM.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, donde la solución tampón está en una concentración desde 10 hasta 100 mM.

27. El procedimiento según la reivindicación 26, donde la solución tampón está en una concentración de 50 mM.

28. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la solución tampón se selecciona del grupo formado por TRIS, MES, o fosfato.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, donde la solución tampón es MES.

30. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde la solución tampón tiene un pH desde 6 a

9.

31. El procedimiento según la reivindicación 30, donde el pH de la solución tampón está entre 7 y 8.

32. El procedimiento según la reivindicación 31, donde el pH de la solución tampón es de 7.0.

33. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, donde se añade a la solución tampón MgCl2 10 mM y DTT 1mM, Acetil-Coenzima A o Propionil-Coenzima A a una concentración entre 0.1 a 10 mM.

34. El procedimiento según la reivindicación 33, donde la Acetil-Coenzima A o la Propionil-Coenzima A están a una concentración entre 0.5 y 2 mM.

35. El procedimiento según la reivindicación 34, donde la Acetil-Coenzima A o la Propionil-Coenzima A están a una concentración de 1 mM.

36. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 35, donde el emulgente es un ácido biliar o sal biliar a una concentración entre 0.05% y 0.2% peso/volumen.

37. El procedimiento según la reivindicación 36, donde el emulgente tiene una concentración del 0.1% en peso/volumen.

38. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, donde el ácido biliar se selecciona del grupo formado por el ácido cólico, ácido desoxicólico, taurocólico, glicocólico, ursodexosicólico, litocólico, o sus sales sódicas y potásicas, dentro del grupo formado por colatos, taurocolatos, deoxicolatos, ursodeoxicolatos o glicocolatos.

39. El procedimiento según la reivindicación 38, donde el emulgente es la sal biliar colato sódico.

40. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, donde en la etapa c) , se añade la enzima Oacetiltransferasa a una concentración de entre 2 y 30 Ig/Il.

41. El procedimiento según la reivindicación 40, donde la enzima se añade a una concentración entre 15 y 25 Ig/Il.

42. El procedimiento según la reivindicación 41, donde la enzima se añade a una concentración de 20 Ig/Il.

43. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 42, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura entr.

3. 40ºC.

44. El procedimiento según la reivindicación 43, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura entr.

3. 38ºC.

45. El procedimiento según la reivindicación 44, donde la reacción de la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura de 10 37ºC.

46. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 45, donde adicionalmente tras la etapa d) se llevan a cabo las siguientes etapas:

- desalar los productos obtenidos tras la etapa d) utilizando un cartucho de fase reversa Sep-Pak C18,

- desecar la muestra en vacío.

15. purificar los diferentes productos por TLC preparativa o HPLC preparativa en una columna amino;

- calcular el peso molecular de los productos mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo;

- caracterización de la posición de las O-acetilaciones u O-propionilaciones mediante secuenciación por espectrometría de masas "electrospray".

47. Uso de un compuesto de fórmula general (I) o de una composición farmacéutica según cualquiera de las 20 reivindicaciones 18 o 19, para la elaboración de un medicamento.

OH

O OY HO OH

X1

O HO OH X3

(I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos,

donde; 25 Y, Ac, X1, X2, X3, X4, X5 y X6 se define como en la reivindicación 1.

48. Uso del compuesto o de la composición según la reivindicación 47, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de tumores.

49. Uso del compuesto o de la composición según la reivindicación 48, donde el tumor se selecciona de la lista que comprende: astrocitoma, glioblastoma, oligodendroglioma, neuroblastoma o meningioma.

50. Uso del compuesto de fórmula general (I) , HO OH

OH

OY

OHX1

COOH

COOH

O

O

OO

HO

X3

AcHN

HO

HO

OH

AcHN

OH

(I)

o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos, donde; Y, Ac, X1, X2, X3, X4, X5 y X6 se definen como en la reivindicación 1, como reactivo en ensayos biológicos.