Genes implicados en la división celular asimétrica.

Un método para aislar genes implicados en la división celular asimétrica,

que comprende:

(1) someter las raíces de una planta tipo natural a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en una forma sincrónica;

(2) someter las raíces de un mutante que no desarrolla raíces laterales mediante un defecto en la señalización de auxina a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en tipo natural en una forma sincrónica;

(3) identificar genes que se inducen en el tipo natural pero no en el mutante;

(4) identificar genes inducidos en periciclo de polo de xilema en plantas tipo natural durante iniciación de raíz lateral

al utilizar una estirpe de marcador GFP específico de periciclo de polo de xilema, seguido por separación celular y análisis de micromatriz de amplio genoma en las células de periciclo de polo de xilema aisladas.

Genes Implicados en la División Celular Asimétrica

La presente invención se relaciona con un método para aislar genes implicados en el proceso de división celular asimétrica. La invención se relaciona adicionalmente con genes aislados utilizando este método, y su uso en controlar la formación de raíces, preferiblemente la formación de raíces laterales.

Para generar la multitud de diferentes tipos celulares presentes en los organismos multicelulares, las divisiones celulares resultan en células hijas con diferentes destinos que son vitales y decisivos en diversos procesos de desarrollo (Scheres & Benfey, 1999) . Este tipo de divisiones se llaman asimétricas, ya sea que la asimetría sea morfológicamente visible o no al momento de la división (Horvitz & Herskowitz, 1992) . Especialmente en las plantas, cuando se limita el movimiento celular, el control del plano de división celular se ha considerado tradicionalmente importante para la formación de patrones regulares, es decir divisiones correctas durante embriogenia o formación de estomas, la formación de filas de células ordenadas en el meristema. (Scheres & Benfey, 1999) .

Durante el ciclo de vida de una planta, ocurren diversas divisiones asimétricas: (a) la primera división del zigoto (Mansfield & Briarty, 1991) ; (b) la división embriónica que da lugar a la célula progenitora con forma de lente del centro en reposo (Dolan et al., 1993) ; (c) la división de microespora macho (Twell et al., 1998) ; (d) divisiones durante la formación del complejo de estomas (Larkin et al., 1997) ; (e) divisiones orientadas a periclinales en el embrión temprano que separa las células progenitoras para los tres tejidos principales, epidermis, tejido secundario, y tejido vascular (Jurgens & Mayer, 1994) ; (f) divisiones de blastocitos que separan las células hijas competentes para diferenciación y nuevos blastocitos en la raíz (Dolan et al., 1993; van den Berg et al., 1995) ; y (g) también durante iniciación de raíz lateral (Casimiro et al., 2003) .

Las divisiones asimétricas difieren fundamentalmente de las divisiones proliferativas estándar en su forma de ocurrencia temporo-espacial limitada. Adicionalmente el número de células implicadas es mínimo. Estas características hacen difícil analizar (genoma amplio) la expresión del transcripto durante este proceso.

Hasta ahora solo se han realizado solo pocos experimentos del perfil del transcripto, en diversos organismos, en procesos en donde se involucran las divisiones celulares asimétricas, es decir durante gliogenia en Drosophila (Egger et al., 2002) , desarrollo de polen de Arabidopsis (Honys & Twell, 2003, 2004; Becker et al, 2003) e iniciación de raíz lateral (Himanen et al., 2004) . Sin embargo, ninguno de estos métodos dirigidos a o que resultan en la identificación de la ruta genética conducen a la división asimétrica propiamente dicha.

En el caso de la iniciación de raíz lateral unas pocas células del periciclo se dividen anticlinalmente y asimétricamente (Casero et al., 1993) . Este no es un proceso continuo y se expone a diversos estímulos ambientales y señales endógenas. Adicionalmente, estas divisiones ocurren solo en aquellas filas de células del periciclo que están en proximidad cercana al polo xilema (Casimiro et al., 2003) . Los métodos de micromatriz han revelado una vista más amplia en la señalización de auxina hacia LRI (Himanen et al., 2004) . Para estos análisis, se utiliza un sistema inducible de raíz lateral. En este sistema, el transporte de auxina, la señalización y la transición del ciclo celular G1 a S se bloquean en las plántulas que crecen en medio complementado con NPA. Posteriormente, estas plántulas se transfieren al medio que contiene auxina (NAA) durante 1-12 horas. Esto permite un inicio inducible de la señalización de auxina y la evolución a través de la transición G1 a S (Himanen et al., 2002) .

Una adaptación de este sistema inducible de raíz lateral también se puede utilizar para el estudio de las divisiones celulares asimétricas. Presentamos un método único que nos permite eludir problemas como especificidad de tejido y el número limitado de células implicadas a través de aislar asimétricamente específicamente las células del periciclo divididas en el polo xilema durante LRI. Por lo tanto combinamos 4 estrategias: 1) un sistema inducible de raíz lateral recientemente desarrollado, que induce sincrónicamente las divisiones asimétricas durante LRI (Himanen et al., 2002) , 2) una estirpe de marcador GFP específico de periciclo de polo de xilema (J0121) , 3) un método de Separación de Células Activadas por Fluorescencia (Birnbaum et al., 2003) , y 4) análisis de micromatriz de amplio genoma en las células aisladas de periciclo de polo de xilema. Esta estrategia combinada nos permite no solo identificar aquellos genes implicados directamente en el proceso LRI sino también extrapolar los resultados para el concepto general de división asimétrica. Encontramos, como reguladores potenciales de las divisiones asimétricas, los genes implicados en la regulación del ciclo celular y un alto porcentaje de genes asociados las dinámicas y organización del citoesqueleto.

Es un primer aspecto de la invención proporcionar un método para aislar genes implicados en la división celular asimétrica, que comprende: (1) someter las raíces de una planta tipo natural a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en una forma sincrónica; (2) someter las raíces de un mutante que no desarrolla raíces laterales mediante un defecto en la señalización de auxina a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en tipo natural en una forma sincrónica; (3) identificar genes que se inducen en el tipo natural pero no en el mutante; (4) identificar genes inducidos en el periciclo de polo de xilema en el tipo natural durante iniciación de raíz lateral utilizando una

estirpe de marcador GFP específico de periciclo de polo de xilema, seguido por separación celular y análisis de micromatriz de amplio genoma en las células aisladas de periciclo de polo de xilema. La iniciación temprana de raíz lateral como se utiliza aquí significa los eventos en diferentes etapas justo antes de la primera división en el periciclo. Preferiblemente esto está dentro de 10 horas después de inducción de auxina de la raíz lateral, más preferiblemente dentro de 8 horas de dicha inducción, aún más preferiblemente 6 horas después de dicha inducción. Preferiblemente, el mutante utilizado es un mutante slr-1.

También se describen aquí genes implicados en la formación temprana lateral de raíces, aislados con el método de acuerdo con la invención. Dichos genes pueden codificar los factores de transcripción, tal como se representa por la SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 19.

Como factores de transcripción se expresan frecuentemente en el tejido de actividad, probablemente sus promotores son de uso económico. Dichos promotores se pueden utilizar en diversas estrategias para mejorar la tolerancia/resistencia al patógeno de la planta.

Los genes implicados en la división celular asimétrica también se pueden aislar con el método de acuerdo con la invención.

Dichos genes pueden comprender una secuencia que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID N° 20- SEQ ID N° 34, o un homólogo de las mismas.

También se describen aquí factores de transcripción implicados en la formación temprana lateral de raíces, por lo cual dicho factor de transcripción se puede seleccionar del grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 19. El gen que codifica dicho factor de transcripción se aísla con el método de la invención.

También se describe aquí el uso de un gen, aislado con el método de la invención, para modular la iniciación temprana de la raíz lateral. La modulación como se utiliza aquí puede ser un aumento o una reducción en el número de raíces laterales, puede ser un aumento o reducción en el tamaño de las raíces laterales o puede ser un cambio en el tiempo (puede ser temprano o más tarde en el desarrollo de la planta) de la formación de raíces laterales. Preferiblemente, dicha modulación es un aumento o reducción en las raíces laterales, aún más preferiblemente es un aumento en las raíces laterales. Dicho gen codifica un factor de transcripción tal como un factor de transcripción seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 34, o un homólogo de los mismos. Dichos genes... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar genes implicados en la división celular asimétrica, que comprende:

(1) someter las raíces de una planta tipo natural a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en una forma 5 sincrónica;

(2) someter las raíces de un mutante que no desarrolla raíces laterales mediante un defecto en la señalización de auxina a un tratamiento que induce iniciación de raíz lateral en tipo natural en una forma sincrónica;

(3) identificar genes que se inducen en el tipo natural pero no en el mutante;

(4) identificar genes inducidos en periciclo de polo de xilema en plantas tipo natural durante iniciación de raíz lateral

al utilizar una estirpe de marcador GFP específico de periciclo de polo de xilema, seguido por separación celular y análisis de micromatriz de amplio genoma en las células de periciclo de polo de xilema aisladas.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho mutante es slr-1.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha estirpe de marcador periciclo de polo de xilema es la estirpe J0121 del marcador GFP.

4. Método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa de identificar genes que se inducen en el tipo natural pero no en el mutante es a través de análisis de micromatriz.

5. Método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dichos genes implicados en la división celular asimétrica se involucran en la formación de raíces laterales.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha formación de raíces laterales es la formación 20 temprana de raíces laterales.

7. Método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dichos genes inducidos en el tipo natural pero no en el mutante son factores de transcripción.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho factor de transcripción se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19 o un homólogo que tiene por lo menos 75% de identidad.