Fabricación de productos metabólicos microbianos secundarios, altamente marcados con isótopos, así como productos metabólicos correspondientes.

Procedimiento para la fabricación de productos metabólicos secundarios,

marcados con isótopos, de hongos o bacterias, para la preparación de una sustancia interna de referencia, en la analítica, para estudios de metabolismo en ensayos de alimentación para el ganado, para estudios metabólicos, para el esclarecimiento de ciclos de metabolismo, formas de degradación y/o períodos de degradación, así como almacenamientos, en un medio sintético líquido de cultivo, caracterizado porque la síntesis se realiza mediante inmovilización de los hongos o bacterias en un soporte inerte, con adición de un medio de cultivo sintético líquido en el que al menos el 95 % de los átomos de carbono, de los átomos de nitrógeno y/o de los átomos de azufre, se han sustituido por isótopos estables.

Fabricación de productos metabólicos microbianos secundarios, altamente marcados con isótopos, así como productos metabólicos correspondientes La invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de productos metabólicos secundarios, marcados con isótopos, de hongos o bacterias, en un medio sintético líquido de cultivo, así como a productos metabólicos secundarios, marcados con isótopos, seleccionados del grupo de las micotoxinas, toxinas o antibióticos.

Las sustancias marcadas con isótopos tienen en la actualidad cada vez mayor importancia, en especial en la tecnología de la cromatografía de líquidos con detección espectrométrica de masas (LCMS) , en la que se hace posible un análisis espectrométrico eficiente con elevado paso de producto. La tecnología se puede emplear para una gran multitud de analitos potenciales, no habiendo ninguna limitación de la masa molecular, no obstante, pudiendo presentarse problemas en la comprobación de las sustancias individuales, partiendo de que tanto los espectros de desintegración, como también los picos moleculares individuales, se tienen que coordinar adecuadamente. Para obtener aquí una aplicación y métodos fiables de LCMS, es de importancia creciente la utilización de las llamadas sustancias internas de referencia. Sustancias internas de referencia son sustancias que presentan una muy elevada similitud con el analito objetivo propiamente dicho, es decir, en especial cuando en lo posible presenten una estructura molecular idéntica, aunque con peso molecular diferente. Como ideales sustancias internas de referencia se muestran pues moléculas marcadas con isótopos del analito objetivo, es decir, en las que uno o varios átomos en la molécula, se sustituyen por sus isótopos. Actualmente se fabrican tales sustancias por síntesis orgánica, sustituyéndose, por ejemplo, hidrógenos o carbonos por los correspondientes isótopos más pesados.

A este respecto, en análisis LCMS se ha mostrado, no obstante, que es deseable que las sustancias marcadas con isótopos, que se utilizan como sustancias internas de referencia, posean una diferencia de masa molecular de al menos 3, para poder obtener una separación clara del analito objetivo, y que cuando sea posible, se deben de llegar a emplear sustancias que se compongan de los menos isotopómeros que sea posible.

Una manera de fabricar metabolitos vegetales o microbianos, marcados con isótopos, es mediante el proceso de biosíntesis de las correspondientes plantas y/o microbios. Aquí se mezclan los medios de cultivo con sustancias nutritivas marcadas radiactivamente, y los componentes nutritivos del medio se incorporan en un cierto porcentaje, en los ciclos anabólicos y metabólicos de los cultivos microbianos o vegetales, de manera que los isótopos se incorporan a los productos metabólicos. Un inconveniente de este procedimiento es que, con este procedimiento únicamente se puede obtener un marcado incompleto, y normalmente se forma una mezcla de los más distintos isotopómeros, con lo que la utilización de tales sustancias marcadas con isótopos, o metabolitos vegetales o microbianos marcados con isótopos, para el empleo como sustancias internas de referencia, parece muy poco apropiada, puesto que al emplear tales sustancias, no se aplicaría una sustancia de referencia, sino una amplia paleta de isotopómeros, con lo que una comprobación acertada de sustancias objetivos en espectrometrías LCMS, de nuevo no parece posible, o sólo lo es con extraordinaria dificultad.

De la cita bibliográfica Wu y otros, Bioquímica analítica 336 (2005) , páginas 164-171, se puede deducir ya un procedimiento para el análisis cuantitativo de los metabolomas microbianos, utilizando una mezcla de metabolitos marcados con 13C uniforme y completamente, como sustancias internas de referencia, en el procedimiento de extracción de metabolitos y subsiguiente análisis LC-ESI-MS/MS [Cromatografía de Líquidos - ElectroSpray Ion / espectrometría de masas], habiéndose cultivado los metabolitos de 13C completos, procedentes de saccharomyces cerevisiae.

De la cita bibliográfica Evans y otros, Bioquímica analítica 306, páginas 197-203 (2002) , se puede deducir ya un procedimiento de análisis LC/MS de la biosíntesis NAD [Dinucleótido de Nicotinamida Adenina], utilizando precursores estables de piridina marcados con isótopos. En este procedimiento se emplea una sustancia interna de referencia, derivada de levadura, que está marcada completamente con relación a los átomos 13C y 15N.

Por Kurzatkowski y otros, Biotecnología aplicada a la microbiología (1984) 19, páginas 312-315, se ha dado a conocer la fabricación de penicilina G marcada radioactiva, mediante micelios inmovilizados de hongos, con el fin de medir la actividad eficaz en la fabricación de penicilina G radioactiva, a partir de valina-14C.

Además, de Carson y otros, Can. J. Microbiol. 43:97-101 (1997) , se puede deducir la biodegradación de Nfosfonometiliminodiácido acético, mediante microorganismos a partir de lodo industrial activado, representando el componente clave en este procedimiento de desintegración, el glifosato, que se marcó con 14C, para poder seguir el proceso de desintegración.

Del documento Blackwell B A y otros: "Estudio NMR [Resonancia Magnética Nuclear] de carbono-13, de la biosíntesis de toxinas por fusarium-graminearum", 1985, Diario de química biológica, tomo 260, nº 7, página (s) 42434247, se puede deducir un estudio de NMR de 13C de la biosíntesis de toxinas por Fusarium Graminearum. Aquí se investigaron estudios de NMR de 13C referentes a la biosíntesis de micotoxinas, que se forman por Fusarium Graminearum, mediante la incorporación de precursores de acetato de [1-13C] y [2-13C].

Del documento Lindenmeier M y otros, Diario de cromatografía, Elsevier Science Publiciaten B.V., Amsterdam NL, tomo 1023, nº 1, 9 de enero de 2004, páginas 47-56, se puede deducir una cuantificación de ocratoxina A en medios nutritivos, mediante un ensayo estable de dilución de isótopos, utilizando HPLC [cromatografía de líquidos de alta eficacia], espectrometría de masas en tándem con cromatografía. En este estudio se desarrolló un ensayo de dilución de isótopos para la cuantificación de la micotoxina ocratoxina A, utilizando [2H5]-OTA como sustancia interna de referencia.

La presente invención tiene como meta poner a disposición un procedimiento para la fabricación de productos metabólicos secundarios, marcados con isótopos, de hongos o bacterias, en los que todos o casi todos los átomos de carbono, átomos de nitrógeno o átomos de azufre en el producto de partida, se sustituyen por isótopos estables, y de este modo se obtiene un único producto final único, marcado con isótopos, el cual se puede comprobar fácilmente y con seguridad en procedimientos espectrométricos, en especial LCMS. La invención tiene, además, como meta la fabricación de un producto metabólico que se pueda emplear o utilizar con seguridad y eficacia, como sustancia interna de referencia, o en procedimientos espectrométricos de análisis, en especial LCMS.

Para la solución de estas misiones, el procedimiento según la presente invención se conduce de manera que la síntesis se realice mediante inmovilización de los hongos o bacterias en un soporte inerte, con adición de un medio de cultivo sintético líquido en el que al menos el 95 % de los átomos de carbono, de los átomos de nitrógeno y/o de los átomos de azufre se hayan sustituido por isótopos estables. Haciendo que la síntesis se realice mediante inmovilización de los hongos o bacterias en un soporte inerte, con adición de un medio de cultivo sintético líquido en el que, en lo esencial, la totalidad o al menos el 95 % de los átomos de carbono, de los átomos de nitrógeno y/o de los átomos de azufre se hayan sustituido por isótopos estables, se logra fabricar un producto metabólico de los hongos y bacterias, marcado con isótopos, en el que la totalidad de los átomos, o al menos el 95 % de los átomos que por cultivo se pueden sacar del medio de cultivo, a saber, átomos de carbono, de nitrógeno o de azufre, están sustituidos por los isótopos estables de las sustancias nutritivas marcadas con isótopos, contenidas en el medio de cultivo y, por tanto, se puede obtener un producto preciso marcado con isótopos, y no, como tantas veces se ha descrito en el estado actual de la técnica, una mezcla de distintos homólogos con número variable de átomos de isótopos. Mediante este procedimiento de fabricación, se puede obtener pues un producto metabólico secundario, marcado con isótopos, que se puede emplear con precisión,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la fabricación de productos metabólicos secundarios, marcados con isótopos, de hongos o bacterias, para la preparación de una sustancia interna de referencia, en la analítica, para estudios de metabolismo en ensayos de alimentación para el ganado, para estudios metabólicos, para el esclarecimiento de ciclos de metabolismo, formas de degradación y/o períodos de degradación, así como almacenamientos, en un medio sintético líquido de cultivo, caracterizado porque la síntesis se realiza mediante inmovilización de los hongos o bacterias en un soporte inerte, con adición de un medio de cultivo sintético líquido en el que al menos el 95 % de los átomos de carbono, de los átomos de nitrógeno y/o de los átomos de azufre, se han sustituido por isótopos estables.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como fuentes de carbono en el medio sintético líquido de cultivo se emplean azúcares o alcoholes sacáridos, en especial glucosa D- [U-13C6], sacarosa 13C, glicerina 13C y/o acetato 13C, como fuentes de nitrógeno, aminoácidos, nitratos compuestos de amonio o urea 15N, como fuente de azufre, sulfatos, sulfuros o aminoácidos 33S ó 34S.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el medio sintético líquido de cultivo contiene adicionalmente una mezcla seleccionada de sales inorgánicas o de ácidos y bases, con los iones Na+, K+, Ca++,

- - -, NO3-

Mg++, Fe+++, Zn++, Cu++, B+++, así como CO3- -, SO4- -, PO4 .

4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque como soporte inerte se emplea un soporte natural o sintético con gran superficie interna, en especial silicato, silicato laminado, zeolita, bentonita, arcilla cocida, tierra de diatomeas, plásticos o similares.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque como soporte inerte se emplea un silicato de aluminio, por ejemplo, una zeolita o un silicato laminado, en especial una vermiculita del grupo de los minerales de mica, en forma natural o tratada.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque como soporte inerte de plástico se emplea material esponjado, poliamida, silicona, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno, poliéster o similar.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la fabricación se realiza a temperaturas entre 3 y 45 ºC, en especial entre 10 y 35 ºC.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque los productos metabólicos secundarios, marcados con isótopos, se obtienen del medio sintético líquido de cultivo, mediante extracción y concentración, por ejemplo, mediante la combinación de etapas como extracción sólido/líquido -líquido/líquido, centrifugación, filtración, evaporación, concentración y vaporización.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque como procedimientos de limpieza, se emplean procedimientos cromatográficos, en especial, cromatografía en columna, cromatografía preparatoria de capa fina, cromatografía iónica, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión y/o cromatografía preparatoria de líquidos, de alto rendimiento.

10. Producto metabólico secundario, marcado con isótopos, en el que al menos el 95 % de los átomos de carbono, de los átomos de nitrógeno y/o de los átomos de azufre, se han sustituido por los correspondientes isótopos estables, seleccionado del grupo de las micotoxinas, tricotesenos, como nivalenol, deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, 15-acetil-deoxinivalenol, fusarenona X, T-2 toxina, HT-2 toxina, DAS, fumonisinas como fumonisina B1, B2 ó B3, ocratoxina A, B, C o D, zearalenonas, moniliformina o aflatoxinas como aflatoxina B1, B2, G1 ó G2, ó antibióticos, los antibióticos formados por actinomicetos, como la tetraciclina, estreptomicina o aminoglucósidos, antibióticos formados especialmente por bacilos, como bacitracina o polimixina, antibióticos formados por penicillium, como penicilina o griseofulvina, o cefalosporina formada por cefalosporium, que haya sido fabricado según alguna de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de una sustancia interna de referencia, en la analítica, para estudios de metabolismo en ensayos de alimentación para el ganado, para estudios metabólicos, para el esclarecimiento de ciclos de metabolismo, formas de degradación y/o períodos de degradación, así como almacenamientos.

11. Producto metabólico secundario según la reivindicación 10, como sustancia pura con un grado de marcado con13C, 15N, 33S ó 34S de al menos el 95 %.