Bacteriófagos como agentes selectivos.

Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende:

formar una mezcla de reacción combinando la muestra con un medio nutritivo y una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos específicos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana compiten con el microorganismo diana por los nutrientes en los medios, y en donde el bacteriófago lisa las bacterias no elegidas como diana en la muestra sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección de falso negativo mediante la inhibición de la proliferación de bacterias no elegidas como diana a la vez que permitiendo al microorganismo diana proliferar en el medio, y

detectar el microorganismo diana.

DESCRIPCiÓN

Bacteriófagos como agentes selectivos Campo de la invención La presente memoria se refiere al campo de la microbiologia y más particularmente se refiere al uso de bacteriófagos en ensayos y procesos microbiológicos Antecedentes de la invención La contaminación bacteriana es la prinCipal causa de infecciones transmitidas por los alimentos y el agua en el mundo que provoca gastroenteritis, diarrea, calambres, vómitos y a menudo fiebre. En los paises subdesarrollados, estas infecciones matan aproximadamente 1, 8 millones de personas al año, la mayoría de los cuales son niños. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) estima que 76 millones de estadounidenses se enferman, más de 300.000 son hospitalizados y 5.000 personas mueren a causa de enfermedades transmitidas por alimentos solo cada año. Después de comer alimentos contaminados, los seres humanos desarrollan diferentes grados de la enfermedad que van desde molestias gastrointestinales breves y leves, tal como la denominada "intoxicación por alimentos", a la enfermedad potencialmente normal. Las infecciones transmitidas por los alimentos más comúnmente reconocidas son las causadas por bacterias tales como, Salmonella, Listaría, Campylobacter, Staphylococcus aureus y E. coli 0157:H7. Por ejemplo, Salmonella se encuentra en el ambiente, particularmente en el intestino de aves, reptiles, animales de granja y seres humanos. La enfermedad en los seres humanos a menudo resulta de la ingestión de carnes, leche o huevos mal cocinados o de la contaminación cruzada de otros alimentos que se comen sin cocinar

Las enfermedades nocivas tales como el cólera y la siguelosis pueden ser transmitidas por agua contaminada y son causadas por bacterias que a menudo se pueden rastrear hasta las fuentes a lo largo de ríos y lagos. Gran parte de la contaminación se puede rastrear hasta los sistemas de alcantarillado sanitario que fugan y desbordan, plantas de tratamiento de aguas residuales, lixiviados de tanques sépticos y materia fecal asociada a escorrentía pluvial de las áreas con altas densidades de fauna silvestre, animales domésticos o ganado. Los principales patógenos bacterianos que se ha demostrado que provocan enfermedades intestinales humanas asociadas al agua potable son :Salmonella typhi (fiebre tifoidea) , Salmonella paratyphi â?¢ A (fiebre paratifoidea) ; otras especies de Salmonella (salmonelosis, fiebre entérica) ; Shigella dystenteriae, S. ffexneri y S. sannei (disenteria bacilar) ; Vibria cha/erae (cólera) ; Leptaspira spp., (Ieptospirosis) ; Yersinia enterocolitíca (gastroenteristis) ; Francisella tularensís , (tularemia) ; Escherichía coli (gastroenteritis) y Pseudomonas aeruginosa (diversas infecciones) . Debido a la gravedad de las enfermedades provocadas por las bacterias transmitidas por el agua y la importancia del agua como recurso natural, se controlan con frecuencia los niveles de bacterias "indicadoras" denominadas bacterias coliformes. Estas bacterias indicadoras generalmente son inofensivas, pero hay algunas excepciones. Determinadas cepas de E. coli se han asociado a infecciones gastrointestinales en adultos, conocidas como diarrea del viajero, infecciones de las vias urinarias y meningitis neonatal. Determinadas cepas de Klebseilla neumonía se han asociado a infecciones gastrointestinales, neumonia, infecciones urinarias intrahospitalarias, infecciones de heridas por quemadura, y como invasores secundarios en otras infecciones respiratorias. Enterobacter se ha asociado con infecciones intrahospitalarias del tracto urinario. Cnrobacter se ha asociado a infecciones urinarias, infecciones de de heridas superficiales, osteomielitis, meningitis neonatal y gastroenteritis.

De manera similar, la contaminación bacteriana en procedimientos de diagnóstico médicos o biológicos presenta un obstáculo problemático y costoso de dichos diagnósticos. La contaminación bacteriana en una muestra biológica tal como sangre, saliva o cultivo tisular puede afectar en gran medida un resultado satisfactorio de muchos ensayos biológicos. Los enfoques frecuentes comprenden el tratamiento de muestras biológicas con dosis muy altas de antibióticos a menudo sin resultados satisfactorios La fermentación bacteriana industrial es otra area comercial afectada por la contaminación bacteriana. La producción industrial de etanol en los Estados Unidos en 2005 se estima en 4, 4 mil millones de galones (16, 7 mil millones de litros) , hasta el doble del año anterior. El etanol se produce utilizando principalmente la fermentación con levadura (Saccharomyces) , siendo el maiz la materia prima predominante. Otros organismos utilizados en menor medida para la producción de etanol comprenden las bacterias Zymomonas mobilis. Otras materias primas comprenden residuos de caña de azúcar, paja de arroz, cebada y trigo, residuos de patata, residuos de madera, residuos urbanos y residuos de la industria de bebidas. Con dichos materiales sirviendo como materia prima, no es sorprendente que la mayoria de las fermentaciones tengan lugar en presencia de contaminación bacteriana significativa. Lactooocillus son los principales contaminantes en la producción de etanol y su presencia y la producción de acido lactico resultante reduce la proliferación de la levadura y el rendimiento en etanol

Del mismo modo, los aminoacidos producidos por la fermentación son predominantemente lisina y ácido glutamico (1 millón de toneladas métricas en conjunto) , con cantidades menores de treonina y triptófano. Esto representa un mercado de 3, 5 mil millones de dólares en todo el mundo. El organismo principal que se utiliza para la producción es Cor y nebacterium glutamicum Las matelias primas para este proceso comprenden residuos de maiz en combinación con los productos de desecho con alto contenido en nitrógeno. Los Bacillus spp. aportan una cantidad considerable de los contaminantes que pueden producirse, y al ser de crecimiento rapido, compiten con el Cor y nebacterium por los nutrientes. Otros productos de fermentación bacteriana comprenden metabolitos, vitaminas, antibióticos y enzimas producidos todos dentro de cultivos de microorganismos que son sensibles a la contaminación bacteriana Los métodos convencionales para la detección de contaminación bacteriana emplean cultivo bacteriano no selectivo o selectivo, o enriquecimiento, seguido de cultivo en placa de los cultivos en medios selectivos para la verificación de las colonias sospechosas. Este enfoque consume mucho tiempo y puede durar varios días antes de que se obtengan resultados. Los métodos alternativos, utilizando inmunoanalisis o tecnologias de detección basadas en ácidos nucleicos, son mas rápidos. Sin embargo, estos métodos aún requieren una etapa de enriquecimiento para la producción de una señal detectable. El tiempo necesario para el enriquecimiento suficiente viene dictado por la tasa de crecimiento de las bacterias diana en la muestra.

La mayoría de los métodos de detección y recuento de bacterias de alta sensibílidad requieren una incubación durante la noche. Ademas, estos métodos a menudo adolecen de una falta de sensibilidad o especificidad o requieren un equipo costoso o considerable ex.periencia técnica para llevar a cabo. Un problema particular con estos métodos es que, durante la etapa de enriquecimiento, casi todas las bacterias en el cultivo gozan de crecimiento mejorado. La presencia de un gran número de bacterias no elegidas como diana en el cultivo de enriquecimiento produce interferencias con la detección de las bacterias diana, dando como resultado falta de sensibilidad, reactividad cruzada, los resultados positivos falsos y negativos falsos. Los científicos han intentado reducir este problema mediante la adición de antibióticos a los cultivos de enriquecimiento. Sin embargo, la presencia de antibióticos en los medios de enriquecimiento disminuye la tasa de crecimiento de las bacterias diana, alarga la cantidad de tiempo necesario para realizar el ensayo y no puede eliminar la reactividad cruzada.

Los ensayos de detección bacterianas más recientemente desarrollados combinan un cultivo bacteriano enriquecido con un bacteriófago lítico, un virus que infecla específicamente las bacterias diana. Los fagos liticos están entre los organismos más simples y mas abundantes en la tierra. Los fagos infectan bacterias anfitrionas respectivas e inyectan ADN del fago. Dentro de bacterias infectadas, el ADN del fago se replica y a continuaciÓn se incorpora en nuevas partículas víricas construidas por el anfitrión bacteriano. Las nuevas partículas de fago se liberan a continuación de sus células bacterianas anfitrionas por un proceso conocido como "lisis", que destruye la célula bacteriana infectada. La lisis permite la infección por fagos posterior de las bacterias... [Seguir leyendo]

Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende·

formar una mezcla de reacción combinando la muestra con un medio nutritivo y una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos especificos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana compiten con el microorganismo diana por los nutrientes en los medios, y en donde el bacleriófago lisa las baclerias no elegidas como diana en la muestra sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección de falso negativo mediante la inhibición de la proliferación de bacterias no elegidas como diana a la vez que permitiendo al microorganismo diana proliferar en el medio, y

detectar el microorganismo diana.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende además la incubación de la mezcla de reacción durante el tiempo suficiente para permitir la lisis de las bacterias no elegidas como diana en la muestra y una proliferación en el número de bacterias diana a concentraciones detectables

3. El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos comprende dos o más bacteriófagos especificos para diferentes bacterias no elegidas como diana.

4. El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es una bacteria.

5. El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacleriófagos comprende un bacteriófago que lisa bacterias gram negativas.

6. El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un bacteri6fago especifico para la lisis de E. coli o Citrobacter.

7. El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un primer bacteriófago especifico para la lisis de E. coli y un segundo bacteriófago específico para la lisis de Citrobacter.

El método de la reivindicación 1 en donde la mezcla de reacción comprende además un antibiótico

9. El método de la reivindicación 8 en donde el antibiótico inhibe la proliferación de bacterias gram positivas.

10. El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana se detecta utilizando un producto químico, una enzima, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo

11. El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos reduce la proliferación de bacterias no elegidas como diana que reaccionan de forma cruzada con un reactivo de detección utilizado para detectar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección falso positivo

12. El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos aumenta la sensibilidad de detección.

El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos inhibe la proliferación de microorganismos competidores acortando de ese modo el tiempo necesario para permitir una proliferación en el número de bacterias diana a concentraciones detectables 14. Un método para enriquecer un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende·

formar una mezcla de incubación combinando la muestra con una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos especificos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, e incubar la mezcla de incubación,

en donde el bacteriófago lisa las bacterias no elegidas como diana en la muestra, dejando viable el microorganismo diana.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la mezcla de incubación comprende además un antibiótico.

16. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación.

17. El método de la reivindicación 14, en donde la composición de bacteriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana 18 El método de la reivindicación 14, en donde la muestra es un reac10r microbiológico para la producción de un producto biológico.

19. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación

20. El método de la reivindicación 1, en donde la composición de bac1eriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana.

. El método de la reivindicación 1, donde la composición de bacteriófagos es un liquido o está en un sustrato sólido o semisólido 22. Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende:

formar una mezcla de reacción combinando la muestra con una composición de bacteriófagos que comprende bac1eriófagos específicos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana en la muestra reaccionan de forma cruzada con un reactivo de detección utilizado para detectar el microorganismo diana, y en donde el bacleriófago lisa las bacterias no elegidas como diana sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de detección de falsos positivos, y detectar el microorganismo diana.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende además la incubación de la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para permitir la lisis de las bacterias no elegidas como diana en la muestra y una proliferación en el número de bacterias diana a concentraciones detectables

24. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos comprende dos o más bacteriófagos especificos para diferentes bacterias no elegidas como diana.

25. El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es una bacteria

26. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos comprende un bacteriófago que lisa bacterias gram negativas.

27. El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un bacteriófago especifico para la lisis de E. coli o Citrobacler.

28. El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un primer bac1eriófago específico para la lisis de E. coli y un segundo bac1eriófago específico para la lisis de Citrobacter.

29. El método de la reivindicación 22, en donde la mezcla de reacción comprende además un antibiótico.

El método de la reivindicación 29, en donde el antibiótico inhibe el crecimiento de bac1erias gram positivas 31 El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana se detecta usando un producto quimico, enzima, molécula de ácido nucleico o anticuerpo

32. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos aumenta la sensibilidad de detección

33. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bac1eriófagos inhibe el crecimiento de microorganismos competidores acortando de ese modo elliempo necesario para permitir una proliferación del número de bacterias diana a concentraciones detectables

34. El método de la reivindicación 22, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación.

35. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana

36. El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos es un líquido o está en un sustrato sólido o semisólido.