Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L1 de VPH31 como se expone en SEC ID Nº:

4, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3.

Expresión optimizada de L1 de VPH 31 en levadura.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a la terapia de virus del papiloma humano (VPH) . Más específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican la proteína L1 de VPH31, y a vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos. La presente invención también se refiere a partículas de tipo virus VPH31 (VLP) y a su uso en vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar VPH.

Antecedentes de la invención

Hay más de 80 tipos de virus del papiloma humano (VPH) , muchos de los cuales se han asociado con una amplia diversidad de fenotipos biológicos, de verrugas proliferativas benignas a carcinomas malignos (para una revisión, véase McMurray y col., Int. J. Exp. Pathol. 82 (1) : 15-33 (2001) ) . VPH6 y VPH11 son los tipos más habitualmente asociados con verrugas benignas, condiloma acuminata no maligno y/o displasia de grado bajo de la mucosa genital

o respiratoria. VPH16 y VPH18 son los tipos de alto riesgo más frecuentemente asociados con carcinomas in situ e invasivos del cuello uterino, vagina, vulva y conducto anal. Más del 90 % de carcinomas cervicales se asocian con infecciones de VPH16, VPH18 o los tipos oncogénicos menos prevalentes VPH31, 33, 45, 52 y 58 (Schiffman y col.,

J. Natl. Cancer Inst. 85 (12) : 958-64 (1993) ) . La observación de que el ADN de VPH se detecta en 90-100 % de cánceres cervicales proporciona fuertes pruebas epidemiológicas de que VPH provoca carcinoma cervical (véase Bosch y col., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002) ) .

Los virus del papiloma son virus de ADN icosaédricos, con envoltura, pequeños (50-60 nm) , que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Las fases abiertas de lectura (ORF) de los genomas virales se designan E1 a E7 y L1 y L2, en las que "E" indica temprano y "L" indica tardío. L1 y L2 codifican proteínas de la cápsida del virus, mientras que los genes E están asociados con funciones tales como replicación viral y transformación celular.

La proteína L1 es la proteína de cápsida principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína de cápsida menor. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la proteína L1. Tanto la proteína L1 como la L2 están altamente conservadas entre diferentes virus del papiloma.

La expresión de la proteína L1 o una combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de insecto, células de mamífero o bacterias conduce a autoensamblaje de las partículas de tipo viral (VLP) (para una revisión, véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, págs. 101-12 (1996) ) . Las VLP son morfológicamente similares a viriones auténticos y son capaces de inducir altas titulaciones de anticuerpos neutralizadores tras su administración a un animal o un ser humano. Debido a que las VLP no contienen el genoma viral potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso de virus vivo en desarrollo de vacuna de VPH (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000) ) . Por esta razón, los genes L1 y L2 se han identificado como dianas inmunológicas para el desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas para infección por VPH y enfermedad.

El desarrollo y la comercialización de vacuna de VPH se han visto obstaculizados por dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión de proteínas de la cápsida en organismos huésped transformados de forma exitosa, limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican proteínas L1 de VPH tales como proteínas L1 de VPH31 (Goldsborough y col., Virology 171 (1) : 306-311 (1989) ) , sería altamente deseable desarrollar una fuente fácilmente renovable de proteínas VPH en bruto que utilice secuencias de nucleótidos que codifican L1 de VPH31 que estén optimizadas para expresión en la célula huésped pretendida. Adicionalmente, sería útil producir grandes cantidades de VLP de L1 de VPH31 que tuvieran las propiedades de conferir inmunidad de las proteínas nativas para su uso en el desarrollo de vacuna.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que inducen o potencian inmunidad a los productos proteicos expresados por genes L1 de VPH31, que se han asociado con cáncer cervical. Específicamente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican proteína L1 de VPH31, como se define en la reivindicación 1, estando dichos polinucleótidos sin señales de terminación de la transcripción internas que se reconocen por levadura, y habiéndose optimizado los codones de los polinucleótidos para expresión de nivel alto en una célula de levadura. La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos para producir partículas de tipo viral (VLP) de VPH31 y desvela el uso de dichas VLP en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedad por VPH o cáncer asociado con VPH.

La presente invención se refiere a moléculas de ADN sintético que codifican la proteína L1 de VPH31. En la invención, la secuencia de nucleótidos de la molécula sintética se altera para eliminar señales de terminación de la transcripción que se reconocen por levadura, y los codones de las moléculas sintéticas se diseñan para usar los codones preferidos por una célula de levadura. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una fuente de proteína L1 de VPH31, que puede autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una vacuna basada en VLP.

La presente invención comprende una molécula de ácido nucleico sintética que codifica la proteína L1 de VPH31 como se expone en SEC ID Nº: 4, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3.

También se proporcionan vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico desveladas a lo largo de la presente memoria descriptiva.

La invención también se refiere a procedimientos para producir VLP de VPH31, y procedimientos para usar VLP de VPH31.

En una realización preferida de la invención, las VLP de VPH31 se producen en levadura. En una realización preferida adicional, la levadura se selecciona del grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", y "el" incluyen la referencia plural a no ser que el contexto claramente indique otra cosa.

Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas:

El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN a la que se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de inicio con ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse activando secuencias denominadas "potenciadores" o "secuencias activadoras cadena arriba" o inhibiendo secuencias denominadas "silenciadores".

El término "vector" se refiere a algún medio por el que pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Existen diversos tipos de vectores incluyendo plásmido, virus (incluyendo adenovirus) , bacteriófagos y cósmidos.

La designación "secuencia de tipo silvestre L1 31" se refiere a la secuencia L1 de VPH31 desvelada en el presente documento como SEC ID Nº: 1. Aunque la secuencia de tipo silvestre L1 de VPH31 se ha descrito previamente, no es extraño encontrar variaciones de secuencia menores entre ADN obtenidos de aislados clínicos. Por lo tanto, se aisló una secuencia de tipo silvestre de L1 de VPH31 representativa de muestras clínicas que previamente se ha mostrado que contenían ADN de VPH31 (véase EJEMPLO 1) . La secuencia de tipo silvestre L1 31 se usó como una secuencia de referencia para comparar las secuencias de L1 de VPH31 con codones optimizados desveladas en el presente documento (véase FIGURA 1) .

La designación "reconstrucción parcial de L1 31" se refiere a una construcción, desvelada... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L1 de VPH31 como se expone en SEC ID Nº: 4, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, en la que la célula huésped es una célula de levadura.

5. La célula huésped de la reivindicación 3, en la que la célula huésped está seleccionada entre el grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, en la que la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae.

7. Un procedimiento para producir partículas de tipo viral (VLP) de L1 de VPH31, que comprende:

(a) transformar levaduras con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;

(b) cultivar la levadura transformada en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico para producir una proteína del virus del papiloma recombinante; y

(c) aislar la proteína del virus del papiloma recombinante para producir las VLP de L1 de VPH31.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la levadura se selecciona del grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. Un procedimiento de fabricación de una vacuna para tratamiento o prevención de infecciones por VPH, comprendiendo dicho procedimiento la producción de VLP de L1 de VPH31 por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende adicionalmente VLP de al menos un tipo de VPH adicional.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que al menos un tipo de VPH adicional está seleccionada del grupo que consiste en: VPH6, VPH11, VPH16, VPH18, VPH33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH52, VPH55, VPH56, VPH58, VPH59 y VPH68.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la vacuna comprende VLP de VPH 16.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la vacuna comprende adicionalmente VLP de VPH 18.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la vacuna comprende adicionalmente VLP de VPH 6 y VLP de VPH11.