La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico,

muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.

Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas

OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELlSAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celiaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El gluten es un conjunto de proteínas de almacenamiento de los cereales. Las proteínas del gluten procedentes del trigo, la cebada, el centeno y, probablemente la avena, no son toleradas por individuos predispuestos genéticamente que padecen la enfermedad celíaca (EC) . En el trigo, el gluten está compuesto por una fracción soluble en etanol (prolaminas: a, 13, y y w-gliadinas) ; y otra insoluble, gluteninas (de alto y bajo peso molecular) (Wieser, 2007, Food Microbiol., 24:115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301 :54-61) . Las gliadinas, así como también las gluteninas, son Inusualmente ricas en residuos de prolina (-15%) y glutamina (-35%) . Como resultado, mientras que la mayoría de las proteínas de la dieta son digeridas mediante proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipéptidos o tripéptidos, las proteínas del gluten no son completamente digeridas (Erickson y Kim, 1990, Annu Rev Med., 41:133-139; Gray, 1991, New York:Oxford University, pp.411-420; Ganapathy y coL, 2006, Academic Press, pp.1667 -1692) . Por lo tanto, algunos de los péptidos del gluten generados durante la digestión gastrointestinal son altamente resistentes a la digestión por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, por lo que persisten en el intestino. Estos péptidos son capaces de internalizarse en las células intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG) . La predisposición genética de los individuos con EC hace que sean intolerantes a dichos péptidos debido a que su sistema inmunológico reacciona de manera patológica contra autoantígenos resultantes de la interacción -péptidos del gluten/tTG- (Korponay-Szabó y col., 2007, BMJ, 335:1244-1247; Bethune y Khosla, 2008, PloS Pathogens, 4:e34; Jabri y Sollid, 2009, Nat Rev Immunol., 9:858-870) . Los péptidos desarninados inducen una reacción inmunológica mediada por células T que ocasiona inflamación crónica del intestino delgado. Las vellosidades intestinales son destruidas debido a la reacción inmunológica, produciéndose disminución de la absorción intestinal que puede dar lugar a síntomas como diarrea, anemia, retraso en el crecimiento, pérdida de peso, desórdenes óseos, complicaciones neurológicas, cáncer, etc. (Alaedini y Green, 2005, Ann Int Med., 142:289-299; Catassi y Fasano, 2008, Curr Opin G, astroenterol., 24:687691; Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213) .

Uno de los principales péptidos del gluten descritos hasta la fecha es el péptido 33-mer de la a2-gliadina (Shan y coL, 2002, Science, 297:2275-2279; Bethune y coL, 2009, Chem BioL, 16:868-881) que ha demostrado ser resistente a la digestión gastrointestinal, sustrato de la desaminación mediada por la tTG y altamente reactivo frente a las células T aisladas de pacientes celíacos. La identificación del péptido 33-mer, así como otros péptidos, contribuye a demostrar que los epítopos dl31 gluten con elevada antigenicidad están localizados en regiones de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan y coL, 2002, Science, 297:2275-2279; Tye-Din y coL, 2010, Sci Transl Med., 2:41ra51) .

La única terapia existente a día de hoy para los pacientes celíacos es una rigurosa dieta sin gluten (OSG) . El incumplimiento de la OSG se ha asociado con osteoporosis, anemia por deficiencia de hierro, depresión e infertilidad, todo lo cual se mejora, en cierta medida, mediante la adhesión a la dieta libre de gluten. Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una OSG para reducir los síntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes, estando entre el 32, 6% y el 55, 4% en las poblaciones estudiadas (Ciacci y coL, 2002, Digestion, 66:178-185; Silvester y Rashid, 2007, Can J Gastroenterol., 21 :557-564) . La falta de adherencia a una dieta libre de gluten de manera estricta es la principal razón de enfermedad celiaca mal controlada en adultos.

Así mismo existe una parte de la población celiaca que no parece responder de manera positiva a la OSG y sufren síntomas de malabsorción persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta población podría ser sospechosa de padecer EC refractaria, una enfermedad rara (aproximadamente el 5%-1 Oolé, de los pacientes con EC) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la dieta libre de gluten (Al-Toma y coL, 2007, Oig Ois, 25:230-236; Freeman, 2009, Gut Liver, 3:237-246; Rubio-Tapia y Murray, 2010, Gut, 59:547-557) . Aunque esta enfermedad refractaria fue descrita en pacientes con supuesta ausencia total de ingesta de gluten, la ingestión involuntaria y la hipersensibilidad a una pequeña cantidad de gluten también pueden desencadenar los síntomas propios de la patología. La falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la OSG es pues todavía una cuestión sin resolver y es especialmente difícil en el caso de leves transgresiones dietéticas (Fernández-Calle y coL, 1993, Gut, 34:774-777) . No hay manera de demostrar la in~lesta de gluten y así evitar posibles secuelas nocivas, de hecho sólo se puede medir las consecuencias de las transgresiones dietéticas observando la inflamación de las mucosas y/o la atrofia vellositaria para lo cual se tendría que realizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con las posibles consecuencias que ello pueda tener.

El control de la anti-tTG, que ha sido propuesto como un marcador para evaluar el estricto cumplimiento de la DSG, sin embargo la eficacia de dicho marcador para controlar la ingesta de gluten aún no está clara (Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213) . Otros marcadores han sido propuestos para el seguimiento de la dieta, como por ejemplo la prueba de permeabilidad (Duerksen et al., 2005) o la calprotectina fecal (Ertekin y col., 2010, J Clin Gastroenterol., 44:544-546.) Estos métodos pueden mostrar que existen procesos inflamatorios, de tal manera que si los valores de estos marcadores se encuentran modificados puede SE'r como consecuencia de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales o de procesos de alergia, lo que significa que no tienen por qué ser una medida dE~1 consumo directo de gluten. Por lo tanto, no existe un método eficaz para comprobar que el enfermo celíaco esté realizando una DSG o descartar la posibilidad de que los síntomas de la EC refractaria sean debidos a una intolerancia hipersensible a trazas de gluten asociada a una exposición involuntaria a los cereales tóxicos.

El cumplimiento de la dieta evaluado mediante entrevista ha sido sugerido como marcador de control de la EC por su bajo coste, su no invasividad, y su demostrada correlación con el daño intestinal. Sin embargo, la DSG supone numerosas restricciones para los pacientes debido a sus implicaciones sociales y económicas. Además, una dieta libre de gluten es difícil de mantener debido a la ubicuidad del gluten en los alimentos, a la desinformación educativa, a las variaciones en el etiquetado de los alimentos y a la posible contaminación cruzada de éstos (Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881; Selimoglu y Karabiter, 2010, J Clin Gastroenterol., 44:4-8) . Por otra parte, ciertos estilos de vida y algunos sectores de la población dificultan, en cierta medida, el cumplimiento de la DSG. Además no existe una alternativa... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces caracterizado por el uso de metodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen péptidos de proteínas del gluten con resistencia a la digestión gastrointestinal.

2. Procedimiento para la monitorización del gluten según la reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con reactividad por algunas de las secuencias del péptid.

3. mer, SEO ID N° 5.

3. Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de las reivindicaciones 1 a 2 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con capacidad para detectar los epítopos contenidos en el péptid.

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4. Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de las reivindicaciones 1 a 3 en el que los métodos inmunológicos usan al menos uno de los anticuerpos monoclonales G12, A1 Y R5.

5. Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de la reivindicaciones 1 a 4 en el que los métodos inmunológicos son un ELlSA indirecto, ELlSA competitivo, ELlSA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, inmunopartículas magnéticas, Western blot, biosensores electrónicos, biosensores de resonancia.

6. Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos del gluten ingeridos según las reivindicaciones 1 a 5 en el que los métodos inmunológicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes.

7. Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunológico según algunas de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia algunos de los péptidos de la reivindicación 3.

8. Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunológico según alguna de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia gliadina hidrolizada con pepsina y tripsina.

9. Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunológico en el que los métodos inmunológicos usan al menos uno de los anticuerpo anti gliadina G12 y A1 para la realización de un ensayo semicuantitativo basado en tiras inmunocromatográficas de detección rápida.

10. Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para la monitorización del cumplimiento de la dieta sin gluten.

11. Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para detectar la ingesta no controlada de gluten en pacientes celíacos sometidos a dieta sin gluten pero con síntomas refractarios y agudos de la enfermedad celíaca.

12. Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para monitorizar la efectividad de las terapias relacionadas con la eliminación de péptidos inmunogénicos del gluten.

13. Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces que comprendan: Una solución dedicada a la extracción del gluten en heces. Un patrón de referencia peptídico que comprenda al me!nos una parte o la totalidad del péptido inmunogénico de.

3. mer de gliadina. Un ensayo inmunológico que usen algún anticuerpo reactivo con el péptido 33mer de gliadina.

14. Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces de la reivindicación 13 que comprenda: Una solución acuosa que tenga en su composición alguno de los componentes siguientes: un agente dispersante, un detergente suave, un agente reductor, un tampón, y etanol. Un patrón de referencia peptídico obtenido por hidrólisis pepsino-tripsinada de gliadina o un péptido sintético que comprenda parte o la totalidad de la secuencia de.

3. mer de la gliadina. Un ensayo inmunológico que usen algún anticuerpo reactivo con el péptido 33mer de gliadina del tipo ELlSA, tiras inmunocromatográficas, inmunoblots, biosensores electrónicos.