Un método para conferir resistencia a los nematodos a una planta,

comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que tiene una región que es absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario de una porción de un gen como el CDPK una vez expresado en la planta; b) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; c) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora; y d) seleccionar la descendencia para resistencia a los nemátodos; en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de: a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2

Composiciones y métodos que utilizan interferencia de ARN de tipo CDPK para el control de nematodos.

El campo de esta invención es el control de nemátodos, en particular con el control de nematodos formadores de quistes de la soja. La invención también se relaciona con la introducción de material genético dentro de plantas que son susceptibles a nemátodos con el propósito de incrementar la resistencia a los nemátodos.

Los nemátodos son lombrices microscópicas que se alimentan sobre las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 cultivos en hilera, vegetales, frutas, y plantas ornamentales, provocando una pérdida de cultivos estimada en $100 mil millones en todo el mundo. Una variedad de especies de nemátodos parásitos, incluidos nemátodos de los nudos de la raíz (RKN) , nematodos formadores de quistes y de lesiones. Los nematodos de los nudos de la raíz, que se caracterizan por causar la formación de agallas en la raíz en los sitios de alimentación, tienen una gama de huéspedes relativamente amplia y son por lo tanto patógenos sobre un gran número de especies de cultivo. Las especies de nemátodos formadoras de quistes y de lesiones tienen una gama de huéspedes más limitada, pero aún provocan pérdidas considerables en cultivos susceptibles.

Los nematodos patógenos están presentes a todo lo largo de los Estados Unidos, presentándose las mayores concentraciones en las regiones húmedas y cálidas del Sur y del Oeste y en suelos arenosos. Los nematodos formadores de quistes de la soja (Heterodera glycines) , la plaga más seria de las plantas de la soja, fue descubierta primero en los Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Algunas áreas están tan fuertemente infestadas por el nematodo formador de quistes de la soja (SCN) que la producción de soja no es económicamente factible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo económico atacado por el SCN, el SCN parasita algunos cincuenta huéspedes en total, incluidos cultivos de campo, vegetales, ornamentales, y malas hierbas.

Los signos de daño por nemátodos incluyen retraso en el crecimiento y amarillamiento de hoja, y marchitamiento de las plantas durante períodos cálidos. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede provocar pérdidas significativas en productividad sin síntomas de enfermedad obvios por encima del suelo. Las causas primarias de reducción en productividad son debidas a daño de las raíces por debajo del suelo. Las raíces infectadas por SCN son enanas o con retraso en el crecimiento. La infestación por nemátodos infestación también puede disminuir el número de nódulos que fijan nitrógeno sobre las raíces, y pueden volver a las raíces más susceptibles a los ataques por otros patógenos de la planta transmitidos por el suelo.

El ciclo de vida de los nemátodos tiene tres etapas principales: embrionaria, juvenil, y adulta. El ciclo de vida varía entre las especies de nemátodos. Por ejemplo, el ciclo de vida del SCN usualmente se puede completar en 24 a 30 días bajo condiciones óptimas mientras que en otras especies puede tomar tanto como un año, o más, para completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y de humedad se tornan favorables en la primavera, eclosionan gusanos juveniles de los embriones en el suelo. Únicamente nemátodos en etapa de desarrollo juvenil son capaces de infectar raíces de soja.

El ciclo de vida de los SCN ha sido sometido a muchos estudios, y como tales son un ejemplo útil para comprender el ciclo de vida del nemátodo. Después de penetrar las raíces de soja, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta que hacen contacto con el tejido vascular, en cuyo momento dejan de migrar y empiezan alimentarse. Con un estilete, el nemátodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforma en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz son morfológicamente transformadas en grandes sincitios multinucleados (o células gigantes en el caso de RKN) , que son utilizados como una fuente de nutrientes para los nemátodos. Los nemátodos que se alimentan activamente roban por lo tanto nutrientes esenciales de la planta lo que resulta en pérdida de productividad. A medida que los nemátodos hembra se alimentan, se hinchan y eventualmente se hacen tan grandes que sus cuerpos atraviesan el tejido de la raíz y quedan expuestos sobre la superficie de la misma.

Después de un período de alimentación, los nematodos SCN, que no están hinchados como los adultos, migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas agrandadas. Los machos mueren luego, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema de la raíz y continúan alimentándose. Los embriones en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco embrionario por fuera del cuerpo, y posteriormente dentro de la cavidad corporal del nemátodo. Eventualmente la cavidad entera del cuerpo de la hembra adulta se llena con embriones, y el nemátodo muere. Es al cuerpo lleno de embriones de la hembra muerta al que se denomina como el quiste. Los quistes eventualmente son desalojados y se encuentran libres en el suelo. Las paredes del quiste se hacen muy duras, proporcionan una excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 embriones contenidos dentro. Los embriones del SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se presenten condicione apropiadas para eclosionar. Aunque muchos de los embriones pueden eclosionar dentro del primer año, muchos sobrevivirán también dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nemátodo puede moverse a través del suelo únicamente unas pocas pulgadas por año por sus propios medios. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede recorrer grandes distancias en una variedad de formas. Cualquier cosa que pueda mover el suelo infestado es capaz de esparcir la infestación, incluida la maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, viento, agua, animales, y los trabajadores agrícolas. Las partículas del suelo del tamaño de las semillas a menudo contaminan las semillas cosechadas. En consecuencia, se puede esparcir la infestación con nemátodos cuando se planta semilla contaminada de campos infestados en campos no infestados. Existe incluso evidencia de que ciertas especies de nemátodos pueden ser esparcidas por los pájaros. Solamente algunas de estas causas pueden ser impedidas.

Las prácticas tradicionales para manejar la infestación por nemátodos incluyen: el mantenimiento apropiado de los nutrientes del suelo y los niveles de pH del suelo en una tierra infestada de nemátodos; el control de otras enfermedades de las plantas, así como plagas de insectos y de mala hierba; el uso de prácticas sanitarias tales como el arado, la plantación, y el cultivo de campos infestados por nemátodos únicamente después de trabajar los campos no infestados; la limpieza completa del equipo con agua o vapor a alta presión después de trabajar en campos infestados; no utilizar semilla que se desarrolló sobre tierra infestada para la plantación de campos no infestados a menos que la semilla haya sido limpiada adecuadamente; la rotación de campos infestados y la alternación de cultivos huéspedes con cultivos no huéspedes; el uso de nematicidas; y la plantación de variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas con el propósito de conferir mayor resistencia a los nematodos que parasitan las plantas. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.589.622 y 5.824.876 están dirigidas a la identificación de genes de plantas expresados específicamente en o en forma adyacente al sitio de alimentación de la planta después de fijación por el nemátodo. Los promotores de estos genes objetivo de la planta pueden ser luego utilizados para dirigir la expresión específica de proteínas o enzimas perjudiciales, o la expresión de ARN antisentido al gen objetivo o a los genes celulares en general. Los promotores de la planta pueden ser utilizados también para conferir resistencia a los nemátodos específicamente en el sitio de alimentación transformando la planta con una construcción que contiene al promotor del gen objetivo de la planta enlazado a un gen cuyo producto induce letalidad en el nemátodo después de ingestión.

Recientemente, la interferencia de RNA (ARNi) , también denominada como silenciamiento génico, ha sido propuesta como un método para controlar nemátodos. Cuando se introduce ARN bicatenario (ARNds) que corresponde esencialmente a la secuencia de un gen objetivo o ARNm en una célula, se inhibe la expresión del gen objetivo (Ver por... [Seguir leyendo]

1. Un método para conferir resistencia a los nematodos a una planta, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que tiene una región que es absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario de una porción de un gen como el CDPK una vez expresado en la planta; b) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; c) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora; y d) seleccionar la descendencia para resistencia a los nemátodos; en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de: a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.

2. El uso de una molécula de ARNds que comprende i) una primera cadena que contiene una secuencia absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, y ii) una segunda cadena que contiene una secuencia complementaria sobre todos sus nucleótidos con la primera cadena, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2

para conferir resistencia a los nemátodos parásitos de la planta.

3. El uso de un reservorio de moléculas de ARNds que comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARNds se derivan de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

c) un polinucleótido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; y d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

para conferir resistencia a los nemátodos parásitos de la planta.

4. Una planta transgénica resistente a nemátodos parásitos capaz de expresar una ARNds que sea absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que tiene 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

c) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.

5. La planta de la reivindicación 4, en donde la ARNds comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARN se derivan de una porción de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que tiene 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.

6. Un método para elaborar una planta transgénica resistente a los nemátodos capaz de expresar un ARNds que inhibe la expresión de un gen como el CDPK en la planta, dicho método comprendiendo las etapas de i) preparar un ácido nucleico que tiene una región que es absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario una vez expresado en la planta; ii) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; iii) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora, y iv) seleccionar la descendencia para expresión de dicho transcripto, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el ARNds comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARN se derivan de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

c) un polinucleótido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; y d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

8. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde la planta se selecciona d entre el grupo que consiste de soja, patata, tomate, cacahuete, algodón, mandioca, café, coco, piña, árboles de cítricos, plátano, maíz, colza, remolacha, girasol, sorgo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, judías verdes, habas, guisantes y tabaco.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el ARNds se expresa en las raíces o sincitios de la planta.

10. Un método para controlar la infección de una planta por un nemátodo parásito, que comprende las etapas de transformar la planta con un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds operativamente enlazada a un promotor preferido del sitio de alimentación del nemátodo o inducible por nemátodo, preferido de la raíz, mediante el 10 cual al ARNds que contiene una cadena que es absolutamente idéntica a una porción de un ácido nucleico objetivo esencial para la formación, desarrollo o soporte del sitio de alimentación, en particular la formación, desarrollo o soporte de sincitios o células gigantes, controlando así la infección de la planta por el nemátodo por medio de la remoción o incapacitando funcionalmente el sitio de alimentación, los sincitios o células gigantes, en donde el ácido nucleico objetivo es un gen como el CDPK, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

Figura 1

19. 3 Glycine max

Figura 1 (continuación)

19. 3 Glycine max 27 Oligo de ARN GeneRacer desconocida 28 Iniciador 5' GeneRacer desconocida 29 Iniciador Anidado 5' GeneRacer desconocida 30 Iniciador RACE 5' 49806575 desconocida 31 Iniciador Anidado RACE 5' 49806575 desconocida 32

FIGURA 2a FIGURA 2b FIGURA 2c

FIGURA 3

Porcentaje de identidad (aminoácidos)

FIGURA 4

Porcentaje de identidad (ácido nucleótido)

Figura 5g

n = número total de nucleótidos de longitud completa de un polinucleótido que codifica como el CDPK – 20

Por ejemplo: n = 1025 (= 1045 - 20) para la SEQ ID NO: 1; n = 300 (= 320 - 20) para la SEQ ID NO: 2; n = 1991 (= 2211 - 20) para la SEQ ID NO: 4; 10 n = 720 (= 740 - 20) para la SEQ ID NO: 5; n = 1663 (= 1683 - 20) para la SEQ ID NO: 8; n = 1699 (= 1719 - 20) para la SEQ ID NO: 10; n = 1684 (= 1704 - 20) para la SEQ ID NO: 12; n = 1675 (= 1695 - 20) para la SEQ ID NO: 14; 15 n = 1696 (= 1716 - 20) para la SEQ ID NO: 16; n = 1585 (= 1605 - 20) para la SEQ ID NO: 18; n = 1552 (= 1572 - 20) para la SEQ ID NO: 20; n = 1549 (= 1569 - 20) para la SEQ ID NO: 22; n = 1519 (= 1539 - 20) para la SEQ ID NO: 24; 20 n = 1669 (= 1689 - 20) para la SEQ ID NO: 26;