Una célula de planta de una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una casete de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP),

en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y un promotor apropiado enlazado operativamente, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de las células de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta

Proteínas proteína-quinasa relacionadas con el estrés y métodos de utilización en las plantas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a células de plantas y plantas de monocotiledóneas o dicotiledóneas que comprenden un ácido nucleico que codifica CPK-2 que confiere tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula o planta, y a métodos correspondientes.

Los estados de estrés ambiental abiótico, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor y estrés por frío, son factores limitantes importantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y las pérdidas de rendimiento de cosecha en cosechas importantes tales como arroz, maíz dulce (maíz común) y trigo causadas por estos estados de estrés representan un factor económico y político importante y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas se ven expuestas típicamente durante su ciclo vital a condiciones de contenido de agua ambiental reducido. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cosecha son muy sensibles a concentraciones más altas de sal en el suelo. La exposición continua a sequía y contenido elevado de sal causan alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial de resolver o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de las plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos limitados de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas remotamente emparentadas representan problemas importantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a la tolerancia a la sequía, el frío y la sal en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la sal son de naturaleza compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo ha hecho infructuosa en gran parte la reproducción orientada a la tolerancia, sino que ha limitado también la posibilidad de modificar por bioingeniería plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Los estados de estrés por sequía, frío y sal tienen un tema común importante para el crecimiento de las plantas, que es la disponibilidad de agua. Las plantas se ven expuestas durante todo su ciclo vital a condiciones de contenido de agua reducido en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo de las plantas, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Dado que un contenido elevado de sal en algunos suelos da como resultado menos agua disponible para captura por las células, su efecto es similar a los observados en condiciones de sequía. Adicionalmente, a temperaturas de helada, las células vegetales pierden agua como resultado de la formación de hielo que comienza en el apoplasto y sustrae agua del simplasto. Por regla general, los mecanismos de respuesta molecular de una planta a cada una de estas condiciones de estrés son comunes, y las proteína-quinasas juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares.

Las proteína-quinasas representan una super-familia y los miembros de esta familia catalizan la transferencia reversible de un grupo fosfato del ATP a las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina y tirosina en las proteínas diana. Las proteína-quinasas son elementos primarios en los procesos de señalización de las plantas y se ha informado que desempeñan papeles cruciales en la percepción y transducción de señales que permiten que una célula (y la planta) respondan a los estímulos ambientales. En particular, las proteína-quinasas receptoras (RPKs) representan un grupo de proteína-quinasas que activan un sistema complejo de caminos de señalización intracelulares en respuesta al ambiente extracelular (Van der Gear et al., 1994 Annu. Rev. Cell Biol. 10: 251-337). Las RPKs son proteínas transmembranales de un solo paso que contienen una secuencia señal amino-terminal, dominios extracelulares singulares para cada receptor, y un dominio citoplásmico de quinasa. La fijación de ligandos induce la homo- o hetero-dimerización de las RPKs, y la proximidad estrecha resultante de los dominios citoplásmicos da como resultado la activación de las quinasas por transfosforilación. Aunque las plantas tienen muchas proteínas similares a RPKs, no se ha identificado ligando alguno para estas quinasas semejantes a receptores (RLKs). La mayoría de las RLKs de las plantas que se han identificado pertenecen a la familia de las serina/treonina (Ser/Thr)-quinasas, y la mayor parte de ellas tienen repeticiones extracelulares ricas en leucina (Becraft, PW. 1998, Trends Plant Sci. 3: 384-388).

Otro tipo de proteína-quinasa es la proteína-quinasa dependiente de Ca+ (CDPK). Este tipo de quinasa tiene un dominio semejante a calmodulina en el término COOH, que permite la respuesta a señales de Ca+ directamente sin que esté presente calmodulina. Normalmente, las CDPKs son las proteína-quinasas Ser/Thr más predominantes encontradas en las plantas superiores. Aunque sus papeles fisiológicos siguen sin estar claros, las mismas son inducidas por frío, sequía y ácido abscísico (ABA) (Knight et al., 1991 Nature 352:524; Schroeder, JI y Thuleau, P., 1991 Plant Cell 3: 555; Bush, D.S., 1995 Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 46: 95; Urao, T. et al., 1994 Mol. Gen. Genet. 244: 331).

Otro tipo de mecanismo de señalización implica miembros de la familia de las proteína-quinasas SNF1 serina/treonina conservadas. Estas quinasas juegan papeles esenciales en la señalización de glucosa y estrés de los eucariotas. Las quinasas semejantes a SNF1 de las plantas participan en el control de enzimas metabólicas fundamentales, que incluyen HMGR, nitrato-reductasa, sacarosa-sintasa, y sacarosa-fosfato-sintasa (SPS). Datos genéticos y bioquímicos indican que la regulación dependiente del azúcar de las quinasas SMF1 implica varios otros componentes sensoriales y de señalización en levaduras, plantas y animales.

Adicionalmente, miembros de la familia de las Proteína-Quinasas Activadas por Mitógenos (MAPK) han sido implicados en las acciones de numerosos estados de estrés ambiental en animales, levaduras y plantas. Se ha demostrado que tanto la actividad de las quinasas semejantes a MAPK como los niveles de mRNA de los componentes de las cascadas de MAPK aumentan en respuesta al estrés ambiental y a la transducción de señales hormonales de las plantas. Las quinasas MAP son componentes de cascadas secuenciales de quinasas, que son activadas por fosforilación de residuos treonina y tirosina por quinasas intermedias de tipo MAP-quinasa situadas aguas arriba (MAPKKs). Las MAPKKs son activadas en sí mismas por fosforilación de residuos serina y treonina por quinasas situadas aguas arriba (MAPKKKs). Cierto número de genes de MAP-quinasa han sido consignados en plantas superiores.

WO 98/26045 describe métodos para aumentar la tolerancia de una planta al estrés ambiental.

Urao, T. et al.; MGG (1994), 244, 4, pp. 331-340 describe dos genes que codifican enfermedades de proteínas dependientes de Ca²⁺ que son inducidas por estados de estrés debidos a sequía y concentraciones altas de sal en Arabidopsis thaliana.

Nishiyama, R., et al., Plant Cell Physiol. (1999), 40, 2, pp. 205-212 describe especies de mRNA que codifican proteína-quinasas dependientes de calcio que se expresan...

1. Una célula de planta de una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una casete de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y un promotor apropiado enlazado operativamente, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de las células de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

2. La célula de la planta de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por el ácido nucleico codificante de PKSRP como se define en SEQ ID NO: 26 y un ácido nucleico codificante de PKSRP que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

3. La célula de la planta de la reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, coco, césped perenne y cosechas forrajeras.

4. Una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Una semilla producida por una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de PKSRP y en donde la semilla es progenie auténtica para una tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

6. Uso de una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea de acuerdo con la reivindicación 4 o una semilla de acuerdo con la reivindicación 5 para la fabricación de un producto agrícola.

7. Una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP) en donde la PKSRP se selecciona del grupo constituido por proteína-quinasa-2 dependiente del calcio (CPK-2) como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y en donde la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

8. Un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por CPK-2 como se define en SEQ ID NO: 26 y una secuencia que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

9. Un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

10. Un método de producción de una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que contiene un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende:

en donde la PKSRP se selecciona del grupo constituido por proteína-quinasa-2 dependiente del calcio (CPK-2) como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por el ácido nucleico codificante de PKSRP como se define en SEQ ID NO: 26 y un ácido nucleico codificante de PKSRP que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

12. Un método de aumentar la tolerancia al estrés por sequía de una planta que comprende

en donde la tolerancia de la planta al estrés por sequía está incrementada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en donde la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de la PKSRP, en donde el promotor está enlazado operativamente al ácido nucleico codificante de PKSRP a expresar.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el promotor se selecciona del grupo constituido por un promotor específico de tejido y un promotor regulado por el desarrollo.