Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos.

Polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que está seleccionada del grupo compuesto de:

(a) secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEC ID Nº: 9;

(b) secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 10;

(c) secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una identidad a lo largo de toda la longitud de al menos el 85 % con un polipéptido que es codificado por las secuencias de ácido nucleico de (a) o (b), presentando el polipéptido actividad desaturasa; y

(d) secuencia de ácido nucleico para un fragmento con al menos 500 nucleótidos sucesivos de un ácido nucleico de (a), (b) o (c), codificando el fragmento un polipéptido con una actividad desaturasa.

Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos La presente descripción se refiere a polinucleótidos de Ostreococcus lucimarinus que codifican desaturasas y elongasas y que se pueden emplear para la producción recombinante de ácidos grasos poliinsaturados. Además, la 5 invención se refiere a vectores, células huésped y organismos transgénicos no humanos que contienen los polinucleótidos así como los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Finalmente, la invención se refiere también a procedimientos de preparación para los ácidos grasos poliinsaturados y para composiciones de aceites, lípidos y ácidos grasos.

Los ácidos grasos y triacilglicéridos tienen múltiples aplicaciones en la industria alimentaria, la alimentación animal, 10 la cosmética y en la industria farmacéutica. En función de si se trata de ácidos grasos saturados e insaturados libres o de triacilglicéridos con un mayor contenido de ácidos grasos saturados o insaturados son adecuados para las más diversas aplicaciones. Los ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido linoleico y linolénico son esenciales para los mamíferos, ya que no se pueden producir por los mismos. Por tanto, los ácidos grasos ï?·-3 y ácidos grasos ï?·-6 poliinsaturados representan un constituyente importante de la alimentación animal y humana. 15

Los ácidos grasos ï?·-3 de cadena larga poliinsaturados tales como ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5ï?5, 8, 11, 14, 17) o ácido docosahexaenoico (=DHA, c22:6ï?4, 7, 10, 13, 16, 19) son importantes componentes de la alimentación humana a causa de sus distintos papeles en la salud, que comprenden aspectos tales como el desarrollo del cerebro infantil, la funcionalidad del ojo, la síntesis de hormonas y otras sustancias señal así como la prevención de afecciones cardiovasculares, cáncer y diabetes (Poulos, A Lipids 30: 1-14, 1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40: 20 211-225, 1999) . Por este motivo existe una demanda en cuanto a la producción de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados.

A causa de la composición habitual actualmente de la alimentación humana es particularmente importante una adición al alimento de ácidos grasos ï?·-3 poliinsaturados que aparecen preferentemente en aceites de pescado. De este modo se añaden, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido docosahexaenoico (=DHA, 25 c22:6ï?4, 7, 10, 13, 16, 19) o ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5ï?5, 8, 11, 14, 17) a alimentos para bebés para aumentar el valor nutritivo. A este respecto, al ácido graso insaturado DHA se le atribuye un efecto positivo en el desarrollo y el mantenimiento de funciones cerebrales. En lo sucesivo, los ácidos grasos poliinsaturados se denominan PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (poly unsaturated fatty acids, PUFA, ácidos grasos poliinsaturados; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga) . 30

Principalmente, los distintos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen de microorganismos tales como Mortierella o Schizochytrium o de plantas productoras de aceite tales como soja, colza, algas tales como Cr y pthecodinium o Phaeodactylum y otras, produciéndose por norma general en forma de sus triacilglicéridos (= triglicéridos = trigliceroles) . Pero también se pueden obtener de animales tales como, por ejemplo, peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante saponificación. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga, tales 35 como DHA, EPA, ácido araquidónico (= ARA, C20:4ï?5, 8, 11, 4) , ácido dihomo-ï?§-linolénico (C20:3ï?8, 11, 4) o ácido docosapentaenoico (DPA, C22:5ï?7, 10, 13, 16, 19) no se sintetizan en plantas de frutos oleaginosos tales como colza, soja, girasol, azafranillo. Son fuentes naturales habituales de estos ácidos grasos pescados tales como arenque, salmón, sardina, gallineta nórdica, anguila, carpa, trucha, rodaballo, caballa, lucio perca o atún o algas.

En función del fin de aplicación se prefieren aceites con ácidos grasos saturados o insaturados. De este modo se 40 prefieren, por ejemplo, en la alimentación humana lípidos con ácidos grasos insaturados, especialmente ácidos grasos poliinsaturados. A los ácidos grasos ï?·-3 poliinsaturados, a este respecto, se le atribuye un efecto positivo en el nivel de colesterol en sangre y, por tanto, en la posibilidad de la prevención de una enfermedad cardíaca. Gracias a la adición de estos ácidos grasos ï?·-3 a la alimentación se puede reducir claramente el riesgo de una enfermedad cardíaca, de una apoplejía o de hipertensión. También se puede influir positivamente en procesos inflamatorios, 45 especialmente inflamatorios crónicos en el marco de enfermedades inmunológicas tales como artritis reumatoide mediante ácidos grasos ï?·-3. Por tanto, se añaden a los alimentos, especialmente a los alimentos dietéticos o se aplican en medicamentos. Los ácidos grasos ï?·-6 tales como ácido araquidónico en el caso de estas enfermedades reumáticas a causa de la composición habitual de nuestros alimentos tienen más bien un efecto negativo sobre estas enfermedades. 50

Los ácidos grasos ï?·-3 y ï?·-6 son precursores de hormonas tisulares, los denominados eicosanoides tales como las prostaglandinas que se derivan del ácido dihomo-ï?§-linolénico, del ácido araquidónico y del ácido eicosapentaenoico, los tromboxanos y los leucotrienos que se derivan del ácido araquidónico y del ácido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (la denominada serie PG2) que se forman a partir de ácidos grasos ï?·-6, por norma general, favorecen reacciones inflamatorias, mientras que los eicosanoides (la denominada serie PG3) de ácidos grasos ï?·-3 tienen un 55 efecto reducido o ninguno en absoluto de favorecimiento de la inflamación.

A causa de sus propiedades positivas, en el pasado no han faltado intentos de poner a disposición genes que intervienen en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en distintos organismos con un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. De este modo, en el documento WO 91/13972 y su equivalente de Estados Unidos se describe una ï?-9-desaturasa. En el documento WO 93/11245 se reivindica una ï?-15-desaturasa, en el documento WO 94/11516 una ï?-12-desaturasa. Otras desaturasas se describen, por ejemplo, 5 en los documentos EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey y col., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y col., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y col., Lipids 34, 1999: 649-659. Sin embargo, la caracterización bioquímica de las distintas desaturasas hasta ahora se ha realizado solo insuficientemente, ya que las enzimas como proteínas unidas a membrana solo se pueden aislar y caracterizar con dificultad (McKeon y col., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y col., Plant Physiol. 10 Biochem., 26, 1988: 777-792) . Por norma general, la caracterización de desaturasas unidas a membrana se realiza mediante introducción en un organismo adecuado que, a continuación, se examina en relación con actividad enzimática mediante análisis de reactante y producto. Las ï?-6-desaturasas se describen en los documentos WO 93/06712, US 5.614.393, US5614393, WO 96/21022, WO00/21557 y WO 99/27111 y también se describe la aplicación para la producción en organismos transgénicos como en los documentos WO98/46763, WO98/46764, 15 WO9846765. A este respecto se describe y reivindica también la expresión de distintas desaturasas tal como en el documento WO99/64616 o el documento WO98/46776 y la formación de ácidos grasos poliinsaturados. En relación con la eficacia de la expresión de desaturasas y su influencia sobre la formación de ácidos grasos poliinsaturados se ha de señalar que mediante la expresión de una única desaturasa, tal como se ha descrito hasta ahora, se han conseguido únicamente contenidos reducidos de ácidos grasos insaturados/lípidos tales como, por ejemplo, ácido ï?§-20 linolénico y ácido estearidónico. Además, por norma general se ha obtenido una mezcla de ácidos grasos ï?·-3 y ï?·-6.

Son microorganismos particularmente adecuados para la producción de PUFA microrganismos tales como microalgas, tales como Phaeodactylum tricornutum, especies de Porphiridium, especies de Thraustochytrium, especies de Schizochytrium o especies de Cr y pthecodinium, ciliados tales como Stylonychia o Colpidium, hongos tales como Mortierella, Entomophthora o Mucor y/o musgos tales como Physcomitrella, Ceratodon y Marchantia (R. 25 Vazhappilly y F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani y K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto y col. (1998) Appl. Biochemistr... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que está seleccionada del grupo compuesto de:

(a) secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEC ID Nº : 9;

(b) secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº : 10; 5

(c) secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una identidad a lo largo de toda la longitud de al menos el 85 % con un polipéptido que es codificado por las secuencias de ácido nucleico de (a) o (b) , presentando el polipéptido actividad desaturasa; y (d) secuencia de ácido nucleico para un fragmento con al menos 500 nucleótidos sucesivos de un ácido nucleico de (a) , (b) o (c) , codificando el fragmento un polipéptido con una actividad desaturasa. 10

2. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, estando compuesto el polinucleótido de ARN o ADN.

3. Vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

4. Vector de acuerdo con la reivindicación 3, siendo el vector un vector de expresión.

5. Vector de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, comprendiendo el vector al menos otro polinucleótido que codifica otra enzima que está incluida en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos. 15

6. Célula huésped que comprende el polinucleótido heterólogo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o el vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo la célula huésped adicionalmente al menos otra enzima que está incluida en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos.

8. Vector de acuerdo con la reivindicación 5 o célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7, estando 20 seleccionada la enzima del grupo compuesto por: acil-CoA-deshidrogenasa (s) , acil-ACP[= acyl carrier protein]-desaturasa (s) , acil-ACP-tioesterasa (s) , ácido graso-acil-transferasa (s) , acil-CoA:lisofosfolípido-aciltransferasa (s) , ácido graso-sintasa (s) , ácido graso-hidroxilasa (s) , acetil-coenzima A-carboxilasa (s) , acil-coenzima A-oxidasa (s) , ácido graso-desaturasa (s) , ácido graso-acetilenasa (s) , lipoxigenasa (s) , triacilglicerol-lipasa (s) , óxido de aleno-sintasa (s) , hidroperóxido-liasa (s) , ácido graso-elongasa (s) , ï?4-desaturasa (s) , ï?5-desaturasa (s) , ï?6-desaturasa (s) , 25 ï?8-desaturasa (s) , ï?9-desaturasa (s) , ï?12-desaturasa (s) , ï?5-elongasa (s) , ï?6-elongasa (s) y ï?9-elongasa (s) .

9. Procedimiento para la preparación de un polipéptido con actividad desaturasa que comprende las etapas:

(a) expresión de un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en una célula huésped; y (b) obtención del polipéptido, que es codificado por el polinucleótido, de la célula huésped.

10. Polipéptido que es codificado por el polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o que se puede 30 obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Organismo transgénico no humano que comprende el polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, el vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5 o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8.

13. Organismo transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 12, siendo el organismos un animal, una 35 planta o un microorganismo pluricelular.

14. Procedimiento para la preparación de una sustancia que presenta la estructura que se muestra en la siguiente fórmula general I

, siendo las variables y los sustituyentes los siguientes 40

R1= hidroxilo, coenzima A (tioéster) , lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol, esfingobase o un radical de fórmula II

R2= hidrógeno, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol o alquil-C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, R3= hidrógeno, alquil-C2-C24-carbonilo saturado o insaturado o R2 y R3 son independientemente entre sí un 5 radical de Fórmula Ia:

n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3;

y 10

comprendiendo el procedimiento el cultivo de (i) una célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5 o (ii) de un organismo transgénico no humano de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 en condiciones que permiten la biosíntesis de la sustancia.

15. Procedimiento para la preparación de una composición de aceites, lípidos o ácidos grasos que comprende las etapas del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 y la etapa adicional de la formulación de la sustancia 15 como composición de aceites, lípidos o ácidos grasos.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, formulándose adicionalmente la composición de aceites, lípidos o ácidos grasos hasta dar un fármaco, hasta dar un producto cosmético, hasta dar un alimento, hasta dar un pienso, preferentemente pienso para peces o hasta dar un complemento alimenticio.

17. Uso del polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, del vector de acuerdo con una de las 20 reivindicaciones 3 a 5, de la célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, del vector o de la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 o del organismo transgénico no humano de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 para la preparación de una composición de aceites, lípidos o ácidos grasos.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, habiéndose de emplear la composición de aceites, lípidos o ácidos 25 grasos como fármaco, producto cosmético, alimento, pienso, preferentemente pienso para peces o complemento alimenticio.