HOMÓLOGO HUMANO DE LA PROTEÍNA "FUSED" DE DROSOPHILA.

[0001] La presente invención se refiere de manera general a moléculas de señalización, específicamente a moléculas de señalización y mediadoras en la cascada hedgehog (Hh) que se encuentran implicadas en la proliferación y diferenciación celulares. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] El desarrollo de los organismos multicelulares depende, por lo menos en parte, de mecanismos que especifican, dirigen o mantienen la información posicional para la formación de células, tejidos u órganos. Se han asociado diversas moléculas de señalización secretadas, tales como elementos de las familias del factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß), de Wnt, de factores de crecimiento fibroblástico y hedgehog, con la actividad de formación de diferentes células y estructuras en Drosophila, así como en vertebrados (Perrimon, Cell 80:517-520, 1995). [0003] Se identificó hedgehog (Hh) por primera vez como un gen de polaridad de segmento mediante un cribado genético en Drosophila melanogaster, Nusslein-Volhard et al., Roux, Arch. Dev. Biol. 193:267-282, 1984, que desempeña una amplia diversidad de funciones en el desarrollo (Perrimon, supra). Aunque únicamente se ha identificado un gen de Drosophila, se han aislado tres homólogos Hh de mamífero: Hh Sonic (SHh), Hh Desert (DHh) y Hh Indian (Ihh) (Echelard et al., Cell 75:1417-30, 1993; Riddle et al., Cell 75:1401-16, 1993). SHh se expresa a nivel elevado en el notocordio y en la placa del piso de embriones de vertebrados en desarrollo. Los ensayos in vitro de explantes, así como la expresión ectópica de SHh en animales transgénicos demuestran que SHh desempeña un papel clave en la formación del tubo neuronal, Echelard et al., supra, 1993; Krauss et al., Cell 74:1431-44 (1993), Riddle et al. Cell 75: 1401-16 (1993), Roelink et al. Cell 81: 445-55 (1995). Los ensayos in vitro de explantes, así como la expresión ectópica de SHh en animales transgénicos demuestran que SHh desempeña un papel clave en la formación del tubo neuronal, Echelard et al., supra, 1993; Ericson et al., Cell 81:745-56, 1995; Marti et al., Nature 375:322-5, 1995; Roelink et al., supra, 1995; Hynes et al., Neuron 19:15-26, 1997). Hh también desempeña un papel en el desarrollo de las extremidades (Krauss et al., Cell 75:1431-44, 1993; Laufer et al., Cell 79:993-1003, 1994), de las somitas (Fan y Tessier-Lavigne, Cell 79:1175-86, 1994; Johnson et al., Cell 79:1165-73, 1994), de los pulmones (Bellusci et al., Develop. 124:53-63, 1997), y de la piel (Oro et al., Science 276:817-21, 1997). De manera similar, IHh y DHh se encuentran implicados en el desarrollo de hueso, intestino y células germinales (Apelqvist et al., Curr. Biol. 7:801-4, 1997; Bellusci et al., Development 124:53-63, 1997; Bitgood et al., Curr. Biol. 6:298-304, 1996; Roberts et al., Development 121:3163-74, 1995). Los ratones sin SHh fortalecieron además la noción de que el SHh es crítico para muchos aspectos del desarrollo de vertebrados, Chiang et al., Nature 383: 407-13 (1996). Estos ratones muestran defectos en las estructuras en la línea media, tales como el notocordio y la placa del piso, ausencia de tipos de células ventrales en el tubo neural, ausencia de estructuras de las extremidades distales, ciclopía, y ausencia de la columna espinal y la mayoría de costillas. [0004] En la superficie celular, se cree que las señales de Hh son transmitidas por la proteína de 12 dominios transmembrana Patched (Ptch) [Hooper and Scott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano et al., Nature 341: 508-13 (1989)] y el receptor del tipo acoplado a proteína G Smoothened (Smo) [Alcedo et al., Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuvel and Ingham, Nature 382: 547-551 (1996)]. La evidencia tanto genética como bioquímica apoyan un modelo de receptor en el que Ptch y Smo son parte de un complejo de receptores multicomponentes, Chen y Struhl, Cell 87: 553-63 (1996); Marigo et al.. Nature 384: 176-9 (1996); Stone et al., Nature 384: 129-34 (1996). Tras la unión de Hh a Ptch, el efecto inhibidor normal de Ptch sobre Smo disminuye, permitiendo que Smo transduzca la señal de Hh a través de la membrana plasmática. La pérdida de mutaciones de función en el gen Ptch se ha identificado en pacientes con el síndrome del nevo de células basales (BCNS), una enfermedad hereditaria caracterizada por múltiples carcinomas de células basales (BCCs). Las mutaciones del gen Ptch disfuncionales también se han asociado con un gran porcentaje de tumores esporádicos de carcinoma de célula basal, Chidambaram et al., Cancer Research 56: 4599-601 (1996); Gailani et al. Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn et al., Cell 85: 841-51 (1996); Johnson et al., Science 272: 1668-71(1996); Unden et al., Cancer Res. 56: 4562-5 (1996), Wicking et al., Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997). Se cree que la pérdida de función de Ptch causa una señalización de Smo incontrolada en carcinoma de células basales. De manera similar, se han identificado mutaciones de Smo activantes en tumores esporádicos de BCC (Xie et al., Nature 391: 90-2 (1998)), enfatizando el papel de Smo como subunidad de señalización en el complejo de receptores para SHh. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual Ptch controla la actividad de Smo aún no se ha aclarado y los mecanismos de señalización por los cuales la señal de Hh se transmite desde el receptor a dianas corriente abajo en la cascada también están por elucidar. El análisis epistático 2 E99909610 15-11-2011   genético en Drosophila ha identificado varios genes de polaridad de segmentos que parecen actuar como componentesn del mecanismo de transducción de señales de Hh, Ingham, Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon, supra. Entre estos se incluyen una molécula de tipo quinesina, Costal-2 (Cos-2) [Robbins et al., Cell 90: 225-34 (1997); Sisson et al., Cell 90: 235-45 (1997)], una proteína designada como fused [Preat et al. Genetics 135: 1047-62 (1993); Therond et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 93: 4224-8 (1996)], una molécula nueva con función desconocida designada como Supresor de fused [Pham et al., Genetics 140: 587-98 (1995); Preat. Genetics 132: 725-36 (1992)] y una proteína de dedeos de zinc Ci. [Alexandre et al., Genes Dev. 10: 2003-13 (1996); Dominguez et al., Science 272: 1621-5 (1996); Orenic et al, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)]. Entre los elementos adicionales implicados en la señalización de Hh se incluyen el factor de transcripción CBP [Akimaru et al.. Nature 386: 735-738 (1997)], el regulador negativo slimb [Jiang and Struhl, Nature 391: 493-496 (1998)] y el elemento de respuesta a SHh COUP-TFII [Krishnan et al., Science 278: 1947-1950 (1997)]. [0005] Los mutantes en Cos-2 son embrionariamente letales y muestran un fenotipo similar a la sobreexpresión de Hh, incluyendo duplicaciones del componente central de cada segmento y dominio de expansión de genes sesnsibles a Hh. En cambio, los embriones mutantes para fused y Ci muestran un fenotipo similar a la pérdida de función de Hh incluyendo la deleción de la parte posterior de cada segmento y la sustitución de la duplicación de la imagen de tipo especular de la parte anterior o cada segmento y sustitución de una duplicación de tipo especular de la parte anterior, Busson et al. Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988). Las caracterizaciones moleculares de Ci sugirieron que es un factor de transcripción que activa directamente los genes sensibles a Hh, tales como Wingless and Dpp, Alexandre et al., (1996) supra, Dominguez et al., (1996) supra. Así mismo, el análisis molecular de fused revela que está estructuralmente relacionado con serina-treonina quinasas y que tanto un dominio N-terminal quinasa intacto como una región reguladora C-terminal son necesarios para su función correcta. Preat et al., Nature 347: 87-9 (1990); Robbins et al., (1997), supra. Therond et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 4224-8 (1996). En concordancia con las supuestas funciones opuestas de Cos-2 y fused, las mutaciones de fused son suprimidas por mutantes de Cos-2 y también por mutantes del Supresor de fused, Preat et al., Genetics 135: 1047-62 (1993). Sin embargo, mientras que las mutaciones nulas de fused y las mutaciones del dominio N-terminal quinasa se pueden suprimir totalmente por las mutaciones del Supresor de fused, las mutaciones en C-terminal de fused muestran un fuerte fenotipo de Cos-2 en una base del Supresor de fused. Esto sugiere que el dominio quinasa de fused puede actuar como un activador constitutivo de la sealización de SHh cuando no está presente el Supresor de fused. Los estudios recientes han mostrado que el fused, Cos-2 y Ci de Drosophila de 92 kDa están presentes en un complejo de multiproteínas asociado con microtúbulos y que la señalización de Hh conduce a la disociación de este complejo de los microtúbulos, Robbins et al, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson et al. Cell 90: 235-45 (1997). Tanto fused como Cos-2 se fosforilan... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que codifica: (i) un polipéptido fused de vertebrado que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos 1 a 1315 de la Figura 1 (SEC ID NO:2); o (ii) un fragmento de polipéptido fused de vertebrado que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 260 de la Figura 1 (SEQ ID NO:24); y en el que el ácido nucleico aislado codifica un polipéptido que tiene actividad biológica de fused, donde dicha actividad biológica de fused comprende una o más entre: - unión a e influencia en la señalización de hedgehog; - regulación de la patogénesis de carcinoma de células basales; - fosforilación o modulación de la fosforilación de Gli; - fosforilación de proteína básica de mielina, sustratos de proteínas de levadura, sustratos de péptidos sintéticos o sustratos de polímeros. 2. Ácido nucleico según la reivindicación 1(i), en el que la identidad de secuencia es de por lo menos un 85%. 3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, en el que la identidad en la secuencia es de por lo menos un 90%. 4. Ácido nucleico según la reivindicación 3, en el que la identidad en la secuencia es de por lo menos un 95%. 5. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, que comprende ADN que codifica un polipéptido fused de vertebrado que tiene una lisina en la posición de aminoácido 33. 6. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc en el Depósito ATCC No. 209637, o una secuencia de nucleótidos que se hibrida al mismo bajo condiciones rigurosas y que codifica un polipéptido que tiene actividad biológica de fused, donde dicha actividad biológica de fused comprende una o más entre: - unión a e influencia en la señalización de hedgehog; - regulación de la patogénesis de carcinoma de células basales; - fosforilación o modulación de la fosforilación de Gli; - fosforilación de proteína básica de mielina, sustratos de proteínas de levadura, sustratos de péptidos sintéticos o sustratos de polímeros. 7. Vector que comprende el ácido nucleico según las reivindicaciones 1, 5, ó 6. 8. Vector según la reivindicación 7, en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 9. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 8. 10. Célula huésped según la reivindicación 9, que es de mamífero. 11. Célula huésped según la reivindicación 10, que es una célula CHO. 12. Célula huésped según la reivindicación 9, que es procariota. 13. Célula huésped según la reivindicación 12, que es E. coli. 14. Célula huésped según la reivindicación 9, que es una célula de levadura. 15. Célula huésped según la reivindicación 14, que es Saccharomyces cerevisiae. 16. Proceso para producir los polipéptidos fused de vertebrado que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas para la expresión de fused de vertebrado y recuperar el fused de vertebrado del cultivo celular. 17. Polipéptido fused de vertebrado aislado que comprende un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de   identidad en la secuencia de aminoácidos con los residuos de aminoácidos 1 a 1315 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) que tiene actividad biológica de fused tal como se define en la reivindicación 1. 18. Polipéptido fused de vertebrado según la reivindicación 17, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos con los residuos de aminoácidos 1 a 1315 de la figura 1 (SEQ ID NO:2) que tiene actividad biológica de fused tal como se define en la reivindicación 1. 19. Polipéptido fused de vertebrado según la reivindicación 18, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con los residuos de aminoácidos 1 a 1315 de la figura 1 (SEQ ID NO:2) que tiene actividad biológica de fused tal como se define en la reivindicación 1. 20. Polipéptido fused de vertebrado según la reivindicación 19, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con los residuos de aminoácidos 1 a 1315 de la figura 1 (SEQ ID NO:2) que tiene actividad biológica de fused tal como se define en la reivindicación 1. 21. Polipéptido fused de vertebrado aislado según la reivindicación 17, que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 1315 de la figura 1 (SEQ ID NO:2). 22. Polipéptido fused de vertebrado aislado que comprende el polipéptido fused humano codificado por los nucleótidos depositados bajo el número de acceso ATCC 209637. 23. Molécula quimérica que comprende el polipéptido fused de vertebrado según la reivindicación 17, fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga. 24. Molécula quimérica según la reivindicación 23, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de epítopo etiqueta. 25. Molécula quimérica según la reivindicación 24, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región constante de una inmunoglobulina. 26. Antagonista de fused de vertebrado que bloquea, evita, inhibe y/o neutraliza el funcionamiento nomal de fused de vertebrado en el mecanismo de señalización de Hh, en la que dicho antagonista es un ácido nucleico antisentido, un anticuerpo anti-fused de vertebrado, o un mutante negativo dominante de fused de vertebrado; y en la que dicho fused de vertebrado es codificado por un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1. 27. Método de cribado de antagonistas de la actividad biológica de fused de vertebrado tal como se define en la reivindicación 1, que comprende: (a) exponer las células diana que expresan fused en un cultivo a un compuesto candidato; y (b) analizar los lisados celulares para valorar el nivel y/o identidad de fosforilación; o (c) valorar los cambios fenotípicos o funcionales en las células tratadas; y comparar los resultados con las células de control que no se expusieron al compuesto candidato; en el que dicho fused es codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 1. 28. Método de diagnóstico para determinar si un trastorno particular está modulado por la señalización de hedgehog, que comprende: (a) cultivar células o tejidos de análisis; (b) administrar un compuesto según la reivindicación 26 que puede inhibir la señalización de hedgehog modulada por fused; (c) medir el grado de atenuación de quinasa en el sustrato de fused en lisados celulares o efectos fenotípicos mediados por hedgehog en las células de análisis; en el que dicho fused es un polipéptido codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 1. 86   Figura 1A Longitud 480 pb (circular) 87   Figura 1B 88   Figura 1C 89   Figura 1D   Figura 1E 91   Figura 1F 92   Figura 2 93   Figura 3A 94   Figura 3B   Figura 3C 96   Figura 3D 97   Figura 3E 98   Figura 4A Longitud 5125 pb (circular) Inicio de 1º ORF 99   Figura 4B   Figura 4C 101 Inicio de la secuención de intrón 2º ORF empieza aquí   Figura 4D 102   Figura 4E 103   Figura 4F 104   Figura 5A Longitud 5252 pb (circular) Traducción de ATG empieza aquí   Figura 5B 106   Figura 5C 107   Figura 5D 108   Figura 5E 109   Figura 5F   Figura 6 B-actina Cerebro fetal Pulmón fetal Hígado fetal Riñón fetal Bazo Timo Próstata Testículos Ovarios Intestino delgado Colon PBL Corazón Cerebro Placenta Pulmón Hígado Músculo esq. Riñón Páncreas 111   112 Adulto   113   Figura 10A Veces de inducción Datos #1 PLÁSMIDOS2 114 Veces de inducción   Figura 10B Unidades relativas de luciferasa (RLU)   116   Figura 12 117