Uso de polinucleótidos de estomatina (STM1) para alcanzar una resistencia a patógenos en plantas.

Un procedimiento para aumentar la resistencia a los patógenos en una planta,

o una parte de la planta,en el que se reduce la actividad de una proteína estomatina STM1 en una planta, o una parte de la planta, en el que la proteína estomatina STM1 está codificada por un polinucleótido que comprende al menos una molécula de ácido nucleico selecccionada de grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que comprende la secuencia como se muestra en SEC ID Nº 2;

b) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la secuencia como se muestra en la SEC ID N º 1;

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC ID Nº 2; y

d) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una homología de al menos un 90% con la secuencia mostrada en la SEC ID N º 1;

Uso de polinucleótidos de estomatina (STM1) para alcanzar una resistencia a patógenos en plantas La invención se refiere a un procedimiento de generar o aumentar una resistencia a patógenos en plantas reduciendo la expresión de al menos un polipéptido de estomatina o un equivalente funcional del mismo. La invención se refiere a nuevas secuencias de ácido nucleico que codifican un poliucleótido de estomatina de Hordeum vulgare (HvSTM1) y describe secuencias homólogas (STM1) de la misma y a su uso en procedimentos para ontener una Resistencia a patógenos en plantas y a construcciones de ácido nucleico, casetes de expression y vectores que comprenden estas secuencias y que son adecuadas para mediar en una resistencia fúngica en plantas. La invención se refiere además a organismos transgénicos, en particular plantas, que se transforman con estos casetes de expresión o vectores, y a cultivos, partes o material de propagación transgénica derivado de las mismas.

Sólo existen algunos enfoques que confieren una resistencia a los patógenos, principalmente hongos patógenos, a las plantas. Esta deficiencia puede atribuirse en parte a la complejidad de los sistemas biológicos en cuestión. Otro dato que se sitúa en el camino de obtener resistencias a patógenos es que poco se sabe sobre las interacciones entre el patógeno y la planta. El gran número de diferentes agentes patógenos, los mecanismos de infección desarrollados por estos organismos y los mecanismos de defensa desarrollados por los filos planta, familias y especies interacconann entre sí de muchas maneras diferentes Los hongos patógenos han desarrollado básicamente dos estrategias de infección. Algunos hongos entran en el tejido del huésped a través de los estomas (por ejemplo, la roya, la especie Septoria, especie Fusarium) y penetran en el tejido del mesófilo, mientras que otros penetran a través de la cutícula en las células epidérmicas debajo (por ejemplo, especies Blumeria) .

Las infecciones causadas por los patógenos fúngicos conducen a la activación de mecanismos de defensa de la planta en las plantas infectadas. Por lo tanto, ha sido posible demostrar que las reacciones de defensa contra los hongos que atraviesan la epidermis con frecuencia se inician con la formación de una resistencia a la penetración (formación de papilas, el fortalecimiento de la pared celular con callosa como componente principal) por debajo de la hifa penetración fúngica (Elliott et al. Mol Plant Microbe Interact. 15: 106 9 -77; 2002 ) .

En algunos casos, sin embargo, los mecanismos de defensa de la planta sólo confieren un mecanismo de protección insuficiente contra el ataque por patógenos.

La formación de una resistencia a la penetración de patógenos cuyo mecanismo infección comprende una penetración de las células de la epidermis o de las células del mesófilo es de gran importancia tanto para plantas monocotiledóneas como para plantas dicotiledóneas. En contraste con la resistencia descrita mediada por mlo, es probable que pueda hacer posible el desarrollo de una resistencia de amplio espectro contra hongos biotróficos obligatorios, hemibiotróficos y necrotróficos.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el objeto de proporcionar un procedimiento para generar una resistencia de las plantas la penetración de patógenos.

El objeto se consigue mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la invención se refiere a un procedimiento para aumentar la resistencia a los patógenos que penetran en una planta monocotiledónea o dicotiledónea, o una parte de una planta, por ejemplo, en un órgano, tejido, una célula o una parte de una célula vegetal, por ejemplo en una orgánulo, que comprende la disminución o la reducción de la actividad de una proteína estomatina de acuerdo con la SEC ID N º 2 (STM1) en la planta, o una parte de la planta, por ejemplo, en un órgano, tejido, una célula o una parte de una célula, por ejemplo en un compartimiento celular, por ejemplo, en un orgánulo, en comparación con una planta de control o una parte de una planta de control, por ejemplo, su órgano, tejido, célula o parte de una célula, por ejemplo en un compartimiento de la celda, por ejemplo en un orgánulo.

Preferentemente, se obtiene una resistencia inespecífica de raza en el procedimiento de acuerdo con la invención Así, por ejemplo, una resistencia de amplio espectro contra hongos o plantas biotróficos y / o hembiotróficos y / o necrotróficos obligatorios, en particular contra patógenos que penentran en el mesófilo, se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la invención.

Sorprendentemente, se ha observado que el silenciamiento de genes a través de dsRNAi de un gen que codifica la proteína estomatina resultados HvSTM1 en un aumento en la resistencia de las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas a patógenos fúngicos. Por lo tanto, esta función de control negativo en caso de ataque de hongos patógenos se ha demostrado para la proteína estomatina HvSTM1 de la cebada (Hordeum vulgare) (HvSTM1) , el trigo (Triticum aestivum) y el berro (Arabidopsis thaliana) .

Se ha encontrado dentro del alcance de un análisis TIGS (= transitoria inducida silenciamiento génico) en la cebada por el procedimiento de Schweizer et al. (2001) 002E ( 2001 ) que un silenciamiento mediado por dsRNAi del gen la HvSTM gen HvSTM aumenta considerablemente la resistencia a la Blumeria graminis f. sp. hordei (sinónimo: Er y siphe graminis DC. f. sp. hordei ) . Este efecto también se ha obtenido en especies dicotiledóneas, tales como, por ejemplo, Arabidopsis thaliana mediante la inducción de de ilenciamiento génico postranscripción (PTGS) . Esto pone de relieve la importancia universal de la función de pérdida de los genes de HvSTM1-homólogas para el desarrollo de una resistencia a los patógenos de amplio espectro de la planta.

La estomatina es una proteína integral de membrana que se identificó en primer lugar en las células de la sangre. En ciertas enfermedades hereditarias, en la que esta proteína está ausente, a se produce anemia hemolítica. En esta estomatocitosis, las células de la sangre sufren una difusión pasiva pronunciada de cationes cargados individualmente, lo que resulta en la hiperhidratación como resultado de una concentración alta de sodio y una concentración baja de potasio. El nombre estomatina deriva de la estructura como una boca de estos eritrocitos (griego estoma = boca) . La estomatina actúa como un regulador negativo de la permeabilidad de membrana para cationes cargados individualmente. La estomatina tiene un dominio único de membrana, mientras que el resto de la proteína sobresale en el citoplasma. Los mecanismos moleculares a través de los cuales la estomatina ejerce su función no están claros. Se supone que el dominio citoplásmico de la proteína actúa estéricamente como una especie de tapón que cierra los canales de iones y tal vez interactúa con el citoesqueleto (Stewart GW, Argent AC, BCJ Dash (1993) Biochem.Biophys.Acta 1225, 15-25; Stewart GW et al. (1992) Blood 79, 1593-1601) .

Una primera potencial estomatina vegetal se clonó en el maíz (Nadimpalli R et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 2957929586) . Sin embargo, no se publicaron datos funcionales de este gen, Zm-STM1. Un posible papel en la defensa frente a patógenos se ha asumido para otros genes que se clonaron en este trabajo, ya que las transcripciones de estos genes estaban reguladas por aumento en la lesión Mimic-Mutante Les9. Si bien este contexto no se ha demostrado para Zm-STM1, los autores especulan sobre un papel como posible regulador positivo de la defensa frente a patógenos, por ejemplo, como promotores de la reacción de hipersensibilidad (HR) . En la misma línea que esta argumentación, otros dos grupos de estudio han encontrado que los genes de las proteínas de Arabidopsis en el fondo de dos mutantes con un aumento de la resistencia están regulados por aumento y, por lo tanto, dicha estomatina podría actuar como proteína PR (Petersen M et al. (2000) Cell 103, 1111-1120; Brodersen P et al. (2002) Genes & Dev. 16, 490-502) .

El hallazgo de que una reducción en la expresión de estomatina conduce a un aumento significativo en la resistencia a patógenos en las plantas era tanto más sorprendente.

En una realización adicional, la invención se refiere, por tanto, a un procedimiento de generación de una planta con una mayor resistencia a patógenos de plantas, preferentemente con una resistencia de amplio espectro, en particular, a patógenos fúngicos, por ejemplo de las clases de Ascomicetos, Basidiomicetos, Quitridiomicetos u Oomicetos , por ejemplo de los mohos de la familia Er y siphaceae, género Blumeria, al... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aumentar la resistencia a los patógenos en una planta, o una parte de la planta, en el que se reduce la actividad de una proteína estomatina STM1 en una planta, o una parte de la planta, en el que la proteína estomatina STM1 está codificada por un polinucleótido que comprende al menos una molécula de ácido nucleico selecccionada de grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que comprende la secuencia como se muestra en SEC ID Nº 2;

b) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la secuencia como se muestra en la SEC ID N º 1;

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC ID Nº 2; y

d) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una homología de al menos un 90% con la secuencia mostrada en la SEC ID N º 1;

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la actividad en las células mesófilas y/o células epidérmicas está reducida.

3. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que la actividad en el lema, palea y/o glumela (primordio de la antera) está reducida.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los patógenos se seleccionan de entre las familias Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae y Hypocreaceae.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que

a) la expresión del polipéptido caracterizado en la reivindicación 1 está reducida;

b) la estabilidad del polipéptido caracterizado en la reivindicación 1 o de las moléculas de ARNm que corresponden al polipéptido está reducida;

c) la actividad del polipéptido caracterizado en la reivindicación 1 está reducida;

d) la transcripción de un gen que codifica el polipéptido caracterizado en la reivindicación 1 se reduce mediante la expresión de un factor de transcripción endógeno o artificial; o e) un factor exógeno que reduce la actividad del polipéptido caracterizado en la reivindicación 1 se añade a la comida o al medio.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la reducción de la actividad del polipéptido caracterizado en las reivindicaciones 1 a 5 se cnsigue aplicando al menos un procedimento selecconado del grupo que consiste en:

a) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica moléculas de ácido ribonucleico adecuadas para formar moléculas de ácido ribonucleico de doble hebra (dsARN) , en las que la hebra sentido de la molécula de dsARN tiene una homología de al menos un 90% con la molécula de ácido nucleico caracterizada en la reivindicación 1 o comprende un fragmento de al menos 17 pares de bases, que tiene una homología de al menos un 90% con una molécula de ácido nucleico caracterizado en la reivindicación 1 (a) o (b) ,

b) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido ribonucleico antisentido que tiene una homología de al menos un 90% con la hebra no codificante de una molécula de ácido nucleico caracterizada en la reivindicación 1 o comprende un fragmento de al menos 15 pares de bases, con una homología de al menos un 90% con una hebra no codificante de una molécula de ácido nucleico caracterizado en la reivindicación 1 (a) o (b) ,

c) introducir una ribozima que escinde específicamente las moléculas de ácido ribonucleico codificadas por una de las moléculas de ácido nucleico mencionadas en la reivindicación 1 o un casete de expresión que asegura la expresión de dicha ribozima,

d) introducir una molécula de ácido nucleico antisentido como se especifica en b) , en combinación con una ribozima o con un casete de expresión que garantiza la expresión de la ribozima, y

e) introducir moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de ácido ribonucleico sentido que codifican un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico caracterizado el la reivindicación 1, en particular, las proteínas como se muestra en la secuencia SEC ID Nº 2, o polipéptidos con una homología de al menos un 90% con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico mencionadas en la reivindicación 1.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende a) la introducción, en una célula vegetal, de un casete de expresión recombinante que comprende, en unión operativa con un promotor que es activo en plantas, una secuencia de ácido nucleico como se caracteriza reivindicación 6 (ae) ;

b) la regeneración de la planta a partir de la célula vegetal, y

c) la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico en una cantidad suficiente y durante un período de tiempo suficiente para generar, o para aumentar, una resistencia a patógenos en dicha planta.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el promotor que es activo en las plantas se selecciona del grupo que consiste en: promotor inducible por patógeno; promotor específico de epidermis o mesófilo; promotor específico de lema, palea y / o glumela (primordio de la antera) y promotor específico de epidermos o mesófilos específicos de lema, palea y / o glumela (primordio de la antera) ; y promotor específico de epidermos o mesófilos específicos de lema, palea y / o glumela (primordio de la antera) inducible por patógenos.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la actividad de un polipéptido de codificación el inhibidor 1 de Bax, ROR2, SnAP34 y / o la proteína de unión lumenal BiP se incrementa en la planta, el órgano de la planta, el tejido de la planta o la célula vegetal .

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la actividad de un polipéptido de codificación ARM1, RacB, CSL1, HvNaOX y / o MLO se reduce en la planta, el órgano de la planta, el tejido de la planta o la célula vegetal.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el inhibidor de Bax 1 se expresa bajo el control del promotor específico del mesófilo-y / o la raíz.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el patógeno se selecciona de entre las especies Puccinia triticina, Puccinia striiformis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae o Microdochium nivale.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la planta se selecciona entre los géneros vegetales Hordeum, Avena, Secale, Triticum, sorgo, Zea, Saccharum y Or y za.