PROTEÍNAS DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN RELACIONADAS CON EL ESTRÉS Y MÉTODOS DE USO EN PLANTAS.

Una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP),

en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta, en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

Campo de la Invención

Esta invención se relaciona en general con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas al estrés abiótico y tolerancia al estrés abiótico en plantas. En particular, esta invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que confieren tolerancia a la sequía, el frío, y/o a la sal. 10

Antecedentes en el Estado del Arte

Los estreses ambientales abióticos, tales como el estrés por sequía, el estrés por salinidad, el estrés por calor, y el estrés por frío, son los principales factores limitantes del crecimiento y productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y de rendimiento de los principales cultivos tales como arroz, maíz y trigo provocadas por estos tipos de estrés representan factores económicos y políticos 15 significativos y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas están típicamente expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de un contenido reducido de agua en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones de sequedad. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son muy grandes, los efectos sobre el desarrollo de las plantas, el crecimiento y 20 rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a concentraciones salinas más altas en el suelo. La exposición continua a la sequía y a alta salinidad provoca alteraciones mayores en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen en última instancia a la muerte celular y por lo tanto a pérdidas de rendimiento. 25

El desarrollo de plantas tolerantes a estrés es una estrategia que tiene el potencial para solucionar o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de fitomejoramiento para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los limitados recursos de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en los 30 cruces entre especies de plantas lejanamente relacionadas representan problemas significativos que se encuentran en fitomejoramiento convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, al frío y a la salinidad en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la salinidad son de naturaleza compleja e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza de múltiples componentes de la tolerancia al estrés ha hecho no solamente 35 que el fitomejoramiento sea muy poco exitoso con respecto a la tolerancia, sino que ha limitado también la habilidad para modificar la tolerancia al estrés por medio de ingeniería genética utilizando métodos biotecnológicos.

Por lo tanto, lo que requiere es la identificación de los genes y de las proteínas involucradas en estos procesos de múltiples componentes que conducen a tolerancia al estrés. La elucidación de la función 40 de los genes expresados en plantas tolerantes al estrés no solamente mejorará nuestra comprensión de la adaptación y tolerancia de las plantas a los estreses ambientales, sino que también puede proporcionar información importante para diseñar nuevas estrategias para el mejoramiento de los cutivos.

Una planta modelo utilizada en el estudio de tolerancia al estrés es Arabidopsis thaliana. Existen al menos cuatro rutas diferentes de transducción de señal que conducen a tolerancia al estrés en la planta 45 modelo Arabidopsis thaliana. Estas rutas están bajo el control de diferentes factores de transcripción (Shinozaki y colaboradores, 2000 Curr. Op. P1. Biol. 3: 217 - 23). Los reguladores de genes, especialmente los factores de transcripción, involucrados en estas rutas de tolerancia son particularmente adecuados para modificar por ingeniería genética la tolerancia en plantas debido a que un único gen puede activar una cascada completa de genes que conducen al fenotipo tolerante. En consecuencia, los 5 factores de transcripción son objetivos importantes en la búsqueda para identificación de genes que confieren a las plantas tolerancia al estrés.

Un factor de transcripción que ha sido identificado en el estado del arte es el factor de transcripción CBF de Arabidopsis thaliana (Jaglo-Ottosen y colaboradores, 1998 Science 280: 104 - 6). La sobreexpresión de este gen en Arabidopsis le confirió tolerancia a la sequía a esta planta (Kasuga y 10 colaboradores, 1999 Nature Biotech. 17: 287 - 91). Sin embargo, CBF es el único ejemplo hasta la fecha de un factor de transcripción capaz de conferir tolerancia a la sequía a las plantas por sobreexpresión.

Aunque se han caracterizado algunos genes que están involucrados en respuestas al estrés en plantas, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia al estrés permanecen muy incompletas y fragmentadas. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que el estrés por sequía y 15 salinidad en algunas plantas puede ser debido a efectos aditivos del gen, en contraste con otras investigaciones que indican que genes específicos son activados en forma transcripcional lo cual conduce a acumulación de nuevas proteínas en tejido vegetativo de las plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque generalmente se asume que las proteínas inducidas por estrés juegan un papel en la tolerancia, se carece todavía de evidencia directa, y las funciones de muchos genes responsables del estrés 20 son desconocidas.

Por lo tanto, existe la necesidad de identificar genes expresados en las plantas tolerantes al estrés que tienen la capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta huésped y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés recientemente generadas tendrán muchas ventajas, tales como un incremento en el rango en el que las plantas de cultivo pueden ser cultivadas, por ejemplo, disminuyendo 25 los requerimientos de aguade una especie de planta.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención reúne en parte la necesidad de identificar factores de transcripción únicos y nuevos capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por sobreexpresión. Es decir, lo que se describe aquí es el factor de transcripción: Homeo Dominio/Cierre de Leucina (HDZ-1) de 30 Physcomitrella patens.

La presente invención proporciona una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica a la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta en donde la TFSRP se selecciona del Homeo 35 Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona de Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11. 40

La invención establece en algunas modalidades que la TFSRP y el ácido nucleico que la codifica se encuentren en miembros del genero Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta de Physcomitrella patens. La invención prevé que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, por metales, químico, patógeno y oxidativo, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental puede ser salinidad, sequía, y temperatura, o combinaciones de los mismos.

La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica TFSRP, en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta y en donde 5 la semilla contiene la TFSRP seleccionada del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO:18,...

1. Una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental 5 comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta, en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y 10 homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11.

2. La planta transgénica de cualquiera de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico y la proteína son de una Physcomitrella patens.

3. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde la TFSRP es el Homeo Dominio/Cierre 15 de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18.

4. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP es el Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11.

5. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde el estrés ambiental se selecciona de salinidad, sequía, y temperatura. 20

6. Una planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde el estrés ambiental es sequía, y la TFSRP es HDZ-1 como se define en la SEQ ID NO: 18.

7. Una planta transgénica de cualquiera de las 1. 2 y 4, en donde el estrés ambiental es sequía, y el ácido nucleico que codifica la TFSRP es HDZ-1 como se define en la SEQ ID NO: 11. 25

8. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

9. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde la planta se selecciona de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, 30 especie Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, té, especie de sauce, palma oleaginosa, coco, pastos perennes y cultivos forrajeros.

10. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la semilla contiene la TFSRP de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, y en donde la planta es 35 una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de la planta de tipo silvestre.

11. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la semilla contiene al ácido nucleico que codifica la TFSRP de cualquiera de las Reivindicaciones 40 1, 2 y 4 y en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de la planta de tipo silvestre.

12. Una proteína aislada del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 o en donde la TFSRP es codificada por una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 11.

13. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína del factor de transcripción de protección relacionada con el estrés (TFSRP), en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP codifica para una TFSRP como se define en la SEQ ID NO: 18. 5

14. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína del factor de transcripción de protección relacionada con el estrés (TFSRP), en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP es como se define en la SEQ ID NO: 11.

15. Un vector aislado de expresión recombinante que contiene un ácido nucleico de cualquiera de las 1. y 14, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en una 10 mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped.

16. Una célula huésped que contiene al vector de la Reivindicación 15.

17. La célula huésped de la Reivindicación 16, en donde la célula está en una planta.

18. Un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica la proteína 15 del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende:

(a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica TFSRP, y 20

(b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta,

en donde la TFSRP y el ácido nucleico que codifica la TFSRP son como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.

19. Un método para incrementar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped 25 comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde se transcribe el gen de interés en respuesta a una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), que comprende:

(a) la transformación de la célula huésped con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica la TFSRP, y 30

(b) la expresión de la TFSRP dentro de la célula huésped, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta a la TFSRP comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped,

en donde la TFSRP y el ácido nucleico que codifica la TFSRP son como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4. 35

20. Un método para identificar una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), que comprende:

(a) elevar una respuesta específica de un anticuerpo a una TFSRP como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3;

(b) seleccionar material putativo de la TFSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento 40 específico del anticuerpo con el material indica la presencia de una TFSRP potencialmente nueva; y

(c) identificar el material enlazado como una TFSRP.

21. Un método para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) en la planta, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

22. El método de la Reivindicación 21, en donde se incrementa la tolerancia al estrés.

23. El método de la Reivindicación 21, en donde disminuye la tolerancia al estrés. 5

24. El método de la Reivindicación 21, en donde la expresión de TFSRP se modifica por la administración de una molécula antisentido que inhibe la expresión de TFSRP, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

25. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta es transgénica.

26. El método de la Reivindicación 25, en donde la planta es transformada con ácido nucleico que 10 codifica TFSRP como se describe en cualquiera de las 1. 2 y 4.

27. El método de la Reivindicación 25, en donde la planta es transformada con un promotor que dirige la expresión de TFSRP nativa, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

28. El método de la Reivindicación 27, en donde el promotor es específico del tejido o es regulado 15 durante el desarrollo.

29. El uso de la proteína aislada del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) de la Reivindicación 12, el ácido nucleico aislado que codifica TFSRP de la Reivindicación 13 ó 14 o el vector aislado de expresión recombinante de la reivindicación 15 para la producción de una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una 20 variedad de la planta de tipo silvestre.

30. El uso de la planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 o de la semilla de la Reivindicación 10 u 11 para la producción de un producto agrícola.

“Siguen 29 páginas de dibujos” 25