Un polipéptido de G-CSF modificado que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 2 y un primer resto químico unido indirectamente mediante un segundo resto químico con un bucle externo;

en el que el bucle externo es el bucle CD en los aminoácidos 119 a 145 o el bucle AB en los aminoácidos 58 a 72; en el que el primer resto químico es polietilenglicol; y en el que la metionina N terminal como se expone en SEC ID Nº 2 es opcional.

Composiciones de análogos de G-CSF y métodos

Campo del invento

Este invento se refiere a compuestos análogos del factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF") . También se describen en este documento composiciones que contienen tales análogos, y composiciones relacionadas, ácidos nucleicos que codifican los presentes análogos de ácidos nucleicos relacionados, células hospedadoras relacionadas y vectores.

Los presentes análogos de G-CSF pueden usarse en métodos de tratamiento.

Antecedentes

La hematopoyesis es controlada por dos sistemas: las células presentes en el microambiente de la medula ósea, y los factores de crecimiento. Los factores de crecimiento, también llamados factores estimuladores de colonias, estimulan a las células progenitoras comprometidas para que estas proliferen y formen colonias de células sanguíneas que se diferencian. Uno de estos factores es el factor estimulador de colonias de granulocitos, aquí llamado G-CSF, el cual estimula preferentemente el crecimiento y el desarrollo de neutrófilos, lo que indica un posible uso en estados neutropénicos (Welte et al., PNAS-USA 82: 1.526-1.530 (1.985) ; Souza et al., Science 232: 61-65 (1.986) ; y Gabrilove, J. Seminars in Hematology 26: (2) 1-14 (1.989) ) .

En seres humanos, el G-CSF endógeno es detectable en el plasma sanguíneo (Jones et al., Bailliere's Clinical Hematology 2 (1) : 83-111 (1.989) . El G-CSF es producido por fibroblastos, macrófagos, células T, trofoblastos, células endoteliales y células epiteliales, y es el producto de expresión de un gen de copia única compuesto de cuatro exones y cinco intrones situados en el cromosoma diecisiete. La transcripción de este locus produce una especie de ARNm que es procesada diferencialmente, lo que da lugar a dos formas de ARNm de G-CSF, una versión que codifica una proteína de 177 aminoácidos y otra que codifica una proteína de 174 aminoácidos (Nagata et al., EMBO J. 5: 575-581 (1.986) ) ; y se ha hallado que la forma compuesta de 174 aminoácidos tiene la mayor actividad biológica específica in vivo. El G-CSF muestra reactividad cruzada de especie, de modo que, cuando se administra G-CSF humano a otro animal mamífero, tal como un ratón, un perro o un mono, se provoca una continua leucocitosis de neutrófilos (Moore et al., PNAS-USA 84: 7.134-7.138 (1.987) ) .

Puede obtenerse y purificarse G-CSF humano a partir de diferentes fuentes. Puede aislarse G-CSF humano natural (nhG-CSF) a partir de los sobrenadantes de líneas cultivadas de células tumorales humanas. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.810.643 (Souza) , ha permitido la producción de cantidades, a escala comercial, de G-CSF en forma glucosilada como un producto de expresión de células huésped eucariotas, y de G-CSF en forma no glucosilada como un producto de expresión de células huésped procariotas.

Se ha hallado que el G-CSF es útil en el tratamiento de estados en los que un aumento de neutrófilos proporciona beneficios. Por ejemplo, para los pacientes con cáncer, el G-CSF es beneficioso como un medio para estimular selectivamente la producción de neutrófilos con objeto de compensar los déficit hematopoyéticos que resultan de una quimioterapia o una radioterapia. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y de sus estados relacionados, tales como la septicemia, que es típicamente causada por un metabolito de bacterias. El G-CSF es también útil, solo o en combinación con otros compuestos, tales como otras citoquinas, para el desarrollo o la multiplicación de células en cultivo para, por ejemplo, trasplantes de médula ósea.

La transducción de señales, el modo mediante el cual el G-CSF afecta al metabolismo celular, no es completamente comprendida en la actualidad. El G-CSF se une a un receptor de la superficie celular que inicia aparentemente los cambios, dentro de las células progenitoras concretas, que conducen a la diferenciación celular.

Se han presentado diversos G-CSF alterados. En general, para el diseño de fármacos, se sabe que ciertos cambios producen ciertos efectos estructurales. Por ejemplo, la supresión de una cisterna podría dar lugar al despliegue de una molécula que, en su estado no alterado, esta normalmente plegada por medio de un puente disulfuro. Hay diferentes métodos conocidos para añadir, suprimir o sustituir aminoácidos con objeto de cambiar la función de una proteína.

Se han preparado muteínas (proteínas con secuencia de aminoácidos alterada) de G-CSF humano recombinante, pero el método de preparación no incluye información sobre la relación entre estructura global y función. Por ejemplo, se han presentado la mutación y la modificación bioquímica de Cys 18 (Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 159: 103-11 (1.989) ; Lu et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 81-92 (1.989) ) .

En la Patente de EE.UU. n° 4.810.643 (anteriormente citada) , titulada "Production of Pluripotent Granulocyte Colony-Stimulating Factor" (Producción de Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos Pluripotenciales) , se describen

de forma general compuestos polipeptídicos análogos y fragmentos peptídicos del G-CSF. Los descritos compuestos análogos específicos de G-CSF incluyen aquellos con las cisteínas de las posiciones 17, 36, 42, 64 y 74 (de las especies de 174 aminoácidos o de las que tienen 175 aminoácidos, siendo el aminoácido adicional una metionina Nterminal) sustituidas por otro aminoácido (tal como serina) , y un G-CSF con una alanina en la posición primera (Nterminal) .

En el Documento EP 0.335.423, titulado "Modified human G-CSF" (G-CSF humano modificado) , se describe un informe sobre la modificación de al menos un grupo amino en un polipéptido que tiene actividad de hG-CSF.

La modificación química de G-CSF humano recombinante por PEG (4.500) o PEG (10.000) se ha descrito en Rita Satake et al., Cell Structure and Function 17: 157-160 (1992) . La unión de PEG con rHuG-CSF potencia su actividad farmacológica in vivo debido a una semivida en plasma más larga pero reduce su actividad in vitro. El aumento fue mayor con PEG (10.000) que con PEG (4.500) .

En el Documento EP 0.272.703, titulado "Novel Polypeptide" (Nuevo Polipéptido) , se describe un informe sobre derivados de G-CSF que tienen un aminoácido sustituido o suprimido en, o cerca de, el extremo N.

En el Documento EP 0.459.630, titulado "Polypeptides" (Polipéptidos) , se describe un informe sobre derivados del G-CSF presente en la naturaleza que tienen al menos una de las propiedades biológicas del G-CSF presente en la naturaleza y una estabilidad en disolución de al menos 35 % para una concentración de 5 mg/ml, teniendo el derivado al menos la Cys17 de la secuencia nativa sustituida por un resto de Ser17, y la Asp27 de la secuencia nativa sustituida por un resto de Ser27.

En el Documento EP 0.256.843, titulado "Expression of G-CSF and Muteins Thereof and Their Uses" (Expresión de G-CSF y Muteínas del Mismo, y sus Usos) , se describe un informe sobre una secuencia de ADN modificada que codifica un G-CSF cuyo extremo N está modificado para obtener una expresión mejorada de la proteína en células huésped recombinantes, sin que cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína.

En el Documento EP 0.243.153, titulado "Human G-CSF Protein Expression" (Expresión de la Proteína Humana G-CSF) , se describe un informe en el que el G-CSF ha de ser modificado inactivando al menos un sitio de procesamiento de proteasas de levadura KEX2 para obtener un rendimiento aumentado en cuanto a la producción de recombinantes usando levadura.

Shaw, en la Patente de EE.UU. n° 4.904.584, titulada "Site-Specific Homogeneous Modification of Polypeptides" (Modificación Homogénea de Polipéptidos, Específica del Sitio) , describe un informe sobre proteínas alteradas en cuanto a la lisina.

En el Documento W0/9012874 se describe un informe sobre variantes de proteínas, alteradas en cuanto a la cisteína.

En la solicitud de patente australiana, Documento n° AU-A-10948/92, titulada "Improved Activation of Recombinant Proteins" (Activación Mejorada de Proteínas Recombinantes) , se describe un informe sobre la adición de aminoácidos a cualquier extremo de una molécula de G-CSF con el fin de ayudar al plegamiento de la molécula tras la expresión procariótica.

En la solicitud de patente australiana, Documento n° AU-A-76380/91, titulada... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de G-CSF modificado que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 2 y un primer resto químico unido indirectamente mediante un segundo resto químico con un bucle externo; en el que el bucle externo es el bucle CD en los aminoácidos 119 a 145 o el bucle AB en los aminoácidos 58 a 72; en el que el primer resto químico es polietilenglicol; y en el que la metionina N terminal como se expone en SEC ID Nº 2 es opcional.

2. Un polipéptido de G-CSF modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo resto químico es un 10 polímero.

3. Un polipéptido de G-CSF modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el bucle externo es el bucle CD.

4. Un polipéptido de G-CSF modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el bucle externo es el bucle AB. 15