Composición sintética con efecto xeroprotector

La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética,

similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa. La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.

Composición sintética con efecto xeroprotector.

La presente invención se refiere a una composición xeroprotectora sintética, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.

La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula

o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa. Además, la presente invención se refiere a un método para la conservación de dicho material biológico.

Estado de la técnica anterior

La conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La liofilización se ha convertido en el método más aceptado para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose por ejemplo de forma muy extendida para la conservación de vacunas atenuadas vivas.

Los métodos actuales de conservación requieren de gran costo en energía y generalmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la liofilización producen reducciones significativas en la actividad/viabilidad del material conservado.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto final, y se requiere aún refrigeración para reducir eldeterioro durante el almacenamiento. Éste es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la “cadena de frío” es difícil, pueden conducir finalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.

Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de microorganismos, plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, lalevadura Saccharomyces cerevisiae o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa (α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido) .

La formación y uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333) . Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol) , palatinit [mezcla de GPS (α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol) y GPM (α-D-glucopiranosil-1-6-manitol) ] y sus componentes individuales GPS y GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados tales como neotrehalosa, laconeotrehalosa, galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, rafinosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0, 2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suficientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistan la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especies de tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a una composición sintética con efecto xeroprotector que comprende glutamina, glucosa y trehalosa, similar a la que puede obtenerse a partir del microorganismo de la especie bacteriana Arthrobacter sp. con número de acceso CECT7623, según se describe en la patente P200931116.

La presente invención también se refiere al uso de la composición xeroprotectora para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado, una célula

o una molécula con actividad biológica como por ejemplo una enzima con actividad lipasa.

La capacidad para conservar material biológico sensible por períodos de tiempo indefinido en forma activa o viable es de importancia en aplicaciones para los sectores médico, agrícola e industrial. En la presente invención se ofrecen herramientas para solucionar la conservación de material biológico que presenta dificultades para su estabilización. El material biológico preservado con la composición es estable por períodos largos de tiempo.

Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el uso de una composición que contiene cada uno de los componentes por separado para la conservación de la actividad de una enzima lipasa, es decir, la suma del efecto en la conservación de la actividad enzimática de una composición que contiene glutamina, glucosa o trehalosa, es menor que el efecto de conservación que produce una composición que contiene todos los componentes, es decir, la composición xeroprotectora tiene un efecto sinérgico en su capacidad de conservar material biológico.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo CECT7623, depositado en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 10 de noviembre de 2009 al que le correspondió el nº de depósito CECT7623, con el término “4J27”, o como “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia/Edificio de investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot (Valencia) .

La composición sintética objeto de esta invención es equivalentes a la que conforman los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 4J27 tras su extracción por secado mediante incubación al aire (4J27D) , según se describe en la patente P20093116.

El término “composición xeroprotectora” tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una composición que previene los efectos adversos de la desecación total o parcial de material de origen biológico o material de origen sintético.

El material biológico se refiere a cualquier compuesto producido directamente por un organismo vivo en cualquier estado de desarrollo, en cualquier compartimento celular, sea cual sea la naturaleza, composición o estructura del mismo, o que procede de un organismo que ya no está vivo. Dicho material biológico puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una célula, ácido nucleico, proteína, enzima, polisacárido, lípido, fosfolípido, liposomas, virus, partículas virales o cualquier molécula que comprenda cualquiera de los elementos anteriores o cualquier molécula orgánica que tenga un efecto farmacológico, inmunogénico y/o fisiológico de acción local y/o sistémica. El material biológico puede comprender agentes terapéuticos; agentes anti-infectivos como antibióticos, antivirales; analgésicos o combinaciones de analgésicos; antiartríticos, antiasmáticos, antiinflamatorios,... [Seguir leyendo]

1. Composición xeroprotectora sintética que comprende glutamina, glucosa y trehalosa.

2. Composición según reivindicación 1 que comprende una proporción de glutamina:glucosa:trehalosa, de entre (0, 5 y 1, 5) : (2 y 4) : (4 y 8) , respectivamente.

3. Composición según la reivindicación 2, donde la proporción de glutamina:glucosa:trehalosa es de entre (0, 7 y 1, 3) : (2, 5 y 3, 5) : (5 y 7) , respectivamente.

4. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.

5. Uso de la composición según la reivindicación 4, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.

6. Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.

7. Uso según la reivindicación 4, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

8. Uso según la reivindicación 7, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.

9. Uso según la reivindicación 8, donde la enzima es una lipasa.

10. Método para la conservación de material biológico que comprende: a) mezclar la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones1a3con una muestra de

material biológico aislado, y b) deshidratar el producto obtenido en el apartado (a) hasta una humedad residual igual o inferior al 10%.

11. Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es un microorganismo o una célula.

12. Método según la reivindicación 10, donde el material biológico del paso (a) es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un órgano aislado o un tejido biológico aislado.

13. Método según la reivindicación 10, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

14. Método según la reivindicación 13, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.

15. Método según la reivindicación 14, donde la enzima es una lipasa.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde la deshidratación de la mezcla de la composición xeroprotectora y del material biológico según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C07H3102 (2006.01) C07H3104 (2006.01)

21 N.O solicitud: 2011000@0 22 Fecha de presentación de la solicitud: 04.12.2009 @2 Fecha de prioridad:

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

18. 19@. A CAI Z. ET AL. Trehalose-6-phosphate synthase 1from Metarhizium anisopliae: clone, expression 1-16 and properties of the recombinant. 22.04.2009. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol.107, No.5, pagina.

49. 505. A MX PA06014490 A (GABRIEL ITURRIAGA DE LA FUENTE) 10.10.2008. 1-16 Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado º para todas las reivindicaciones º para las reivindicaciones nO: Fecha de realización del informe 10.05.2012 Examinador I. Rueda Molins Pagina 1/4

NO de solicitud: 2011000@0

Documentación minima buscada (sistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación) C07H Bases de datos electrónicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de

busqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 2011000@0

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 10.05.2012

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo @1.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina @/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 2011000@0

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

18. 19@. 2008 D02 CAI Z. ET AL. Trehalose-6-phosphate synthase 1 from Metarhizium a nisopliae: clone, expression and properties of the recombinant. Journal of B ioscience and B ioengineering. Vol.107, No.5, pagina.

49. 505. 22.04.2009 D0@ MX PA06014490 A (GABRIEL ITURRIAGA DE LA FUENTE) 10.10.2008

2. Declaración motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

En la invención de la solicitud de patente se reivindica una composición xeroprotectora sintetica que comprende glutamina, glucosa y thehalosa.

El documento D01 muestra una relación entre la glucosa y la tolerancia a la sequia. Los documentos D02 y D0@ divulgan como la trehalosa aumenta la tolerancia frente a la desecación.

Ninguno de los documentos citados divulga una composición xeroprotectora sintetica que comprende glutamina, glucosa y thehalosa. Por tanto, teniendo en cuenta la información divulgada en los documentos D01, D02 y D0@ las reivindicaciones 116 presentan novedad y actividad inventiva segun lo establecido en los Articulos 6 y 8 LP 11/1986.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4