Una bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos,

en la que dicha bacteria corineforme está modificada para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación con una cepa de tipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de la expresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA se selecciona entre el grupo que consiste en:

(A) un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y

(B) un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

Bacteria productora de l-aminoácidos y procedimiento para producir l-aminoácidos

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir L-aminoácidos generados por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio durante la fermentación de bacterias corineformes, particularmentelos L-aminoácidos L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-valina, L-alanina y L-lisina.

ANTECEDENTES DE LA TÃCNICA

Un L-aminoácido, tal como el ácido glutámico, se genera por ruta biosintética usando ácido pirúvico comointermedio, y convencionalmente se ha producido a escala industrial mediante procedimientos de fermentación utilizando bacterias corineformes, incluyendo Brevibacterium y Cor y nebacterium, que tienen la capacidad de producir Laminoácidos. Para mejorar la productividad L-aminoácidos de bacterias corineformes, se han usado cepas aisladas demutantes naturales o artificiales de las mismas (documentos JP07-121228B, JP07-121228B, JP06-237779A, Adv.Biochem. Eng. Biotechnol. 2003; 79: 59-112. J. Biotechnol. 4 de sep. de 2003; 104 (1-3) : 155-72 y WO95/34672) .

Cuando se cultivan bacterias aeróbicas, especialmente bacterias corineformes, en condiciones limitadas deoxígeno, se acumulan ácidos orgánicos distintos de la sustancia diana, tales como ácido láctico y ácido acético, encantidades en exceso en forma de subproductos. Dicha acumulación inhibe el crecimiento de las bacterias y reduce engran medida su productividad durante la fermentación. Además, son necesarias cantidades en exceso de contraionesque neutralicen dichos ácidos orgánicos, lo que aumenta el coste de producción. Por consiguiente, se ha deseado la creación de cepas que produzcan menos ácido acético durante el cultivo, tales como cepas en las que se reduce o elimina la actividad de una enzima que cataliza la producción de ácido acético.

Los ejemplos de un procedimiento de fermentación que usa una cepa en la que se reduce o elimina la actividadde una enzima que cataliza la producción de ácido acético incluyen la producción de L-aminoácidos usando Escherichia coli que es deficiente en actividades de fosfoacetiltransferasa (pta) y lactato deshidrogenasa (Idh) (documento WO99/06532) , la producción de L-aminoácidos usando la familia Enterobacteriaceae que es deficiente en actividad de piruvato oxidasa (poxB) , y la producción de D-ácido pantoteico usando Enterobacteriaceae que es deficiente en la actividad de piruvato oxidasa (poxB) (documento WO02/36797) .

Se han reseñado acetato cinasa (ack) y fosfotransacetilasa (pta) como enzimas que están implicadas en laasimilación del ácido acético en bacterias corineformes (Microbiology, feb. de 1999; 145 (Pt2) : 503-13) . Además, se hareseñado una bacteria corineforme en la que está alterada la enzima productora de acetato piruvato oxidasa (poxB) (documento EP1096013A) .

La acetil-CoA hidrolasa es una enzima (3.1.2.1) que produce ácido acético a partir de acetil-CoA y H2O, y se ha dado a conocer la secuencia nucleotídica predicha que codifica acetil-coA hidrolasa de Cor y nebacterium glutamicum (documento EP1108790A) . Sin embargo, no se ha reseñado el análisis de clonación y expresión real del gen; y por lotanto la función real del gen no se ha confirmado todavía.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria corineforme que tenga una capacidadmejorada para producir L-aminoácidos que se generan por ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, y proporcionar un procedimiento para producir de forma eficaz los L-aminoácidos que se han mencionado anteriormenteusando una bacteria de este tipo.

Los inventores de la presente invención han estudiado extensamente para conseguir los objetos que se han mencionado anteriormente. Como resultado, descubrieron que disminuyendo la actividad de acetil-CoA hidrolasa en unabacteria corineforme, aumenta la capacidad para producir L-aminoácidos, particularmente L-ácido glutámico, L-valina y L-alanina, y realizaron de esta manera la presente invención.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria corineforme que tenga capacidad de producirL-aminoácidos, en la que dicha bacteria corineforme se modifica para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación de una cepa de tipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de la expresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidosgenerados por una ruta biosintética usando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA hidrolasase selecciona entre el grupo que consiste en:

(A) un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y

(B) un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicha acetil-CoA hidrolasa se selecciona entre el grupo que consiste en:

(A) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24; y

(B) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24, con lo que uno o variosaminoácidos en dicha proteína se sustituyen, eliminan, insertan o añaden, y en la que dicha proteína tiene actividad deacetil-CoA hidrolasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicha bacteria corineforme se modifica adicionalmente para aumentar la actividad de glutamatodeshidrogenasa mediante transformación con un plásmido que contiene un gen que codifica glutamato deshidrogenasa; integrando dicho gen en un cromosoma por recombinación homóloga, conjugación o transposición, o introduciendo unamutación en una región promotora de dicho gen o sustituyendo por un promotor fuerte.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente, en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste enL-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende: cultivar la bacteria corineforme como se ha descrito anteriormente en un medio, y recoger el L-aminoácido del medio, y en el que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados a través de ácido pirúvico comointermedio.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar el procedimiento que se ha descrito anteriormente, enel que dichos L-aminoácidos son uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS3. La Fig. 2 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS4. La Fig. 3 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pBS5T. La Fig. 4 es un esquema que muestra el procedimiento de la construcción del plásmido pLldh56-1. La Fig. 5 es un esquema que muestra el procedimiento de construir el plásmido pBS4S::Lach.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

En lo sucesivo en este documento, se describirán en detalle realizaciones de la presente invención.

<1> Bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos generados por ruta sintética usando ácido pirúvico como intermedio En la presente invención, los ejemplos de bacteria corineforme incluyen una bacteria corineforme convencional, y también incluyen bacterias que se habían clasificado en el género Brevibacterium, pero que actualmente se clasifican en el género Cor y nebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991) ) , así como bacterias Brevibacterium que están muy cercanas a las bacterias Cor y nebacterium. Los ejemplos de dicha bacteria corineforme incluyen los siguientes:

Cor y nebacterium acetoacidophilum Cornynebacterium acetoglutamicum Cor y nebacterium... [Seguir leyendo]

1. Una bacteria corineforme que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos, en la que dicha bacteriacorineforme está modificada para que la actividad de acetil-CoA hidrolasa disminuya en comparación con una cepa detipo natural o no modificada como resultado de una mutación en la región codificante o una región reguladora de laexpresión de un gen cromosómico de acetil-CoA hidrolasa, o como resultado de la alteración del gen cromosómico deacetil-CoA hidrolasa, y en la que dicho L-aminoácido es uno o más L-aminoácidos generados por ruta biosintéticausando ácido pirúvico como intermedio, en la que dicho gen de acetil-CoA se selecciona entre el grupo que consiste en:

(A) un gen que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23; y

(B) un ADN que puede hibridar en condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende los nucleótidos 1037 a 2542 de la SEQ ID NO: 23, y que codifica una proteína que tiene actividad de acetil-CoA hidrolasa.

2. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha acetil-CoA hidrolasa se seleccionaentre el grupo que consiste en:

(A) una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24; y

(B) una proteína que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 24, con lo que uno o variosaminoácidos en dicha proteína están sustituidos, eliminados, insertados o añadidos, y en la que dicha proteína tieneactividad de acetil-CoA hidrolasa.

3. La bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha bacteriacorineforme está modificada adicionalmente para aumentar la actividad de glutamato deshidrogenasa mediante sutransformación con un plásmido que contiene un gen que codifica glutamato deshidrogenasa; integrando dicho gen enun cromosoma por recombinación homóloga, conjugación o transposición; o introduciendo una mutación en una regiónpromotora de dicho gen o sustituyendo por un promotor fuerte.

4. La bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho Laminoácido es uno o más L-aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, Lglutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina y L-lisina.

5. Un procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende: cultivar la bacteria corineforme de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 es un medio y recoger el L-aminoácido del medio, y en el que dicho Laminoácido es uno o más L-aminoácidos generados mediante ácido pirúvico como intermedio.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dichos L-aminoácidos son uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-ácido glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, Lalanina, L-valina y L-lisina.