Un anticuerpo aislado que se une específicamente a EphA2 con una Koff inferior a 3 x 10 -3 s -1 e induce fosforilación de la EphA2,

en el que: a. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-102.147 producido por el hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y número de registro asignado PTA-4572; b. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-208.261 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4573; c. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-210.248 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4574; d. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-233.152 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-5194; e. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA- 4572; f. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA- 4573; g. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA- 4574; h. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA- 5194; i. el anticuerpo comprende una cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 o 21 y una cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 o 17; j. el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3 o 19, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o 20, una CDR de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 o 22, una CDR2 de VH que tiene a secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 o 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 o 24; o k. el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3 o 19, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o 20, una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 o 22, una CDR2 de VH que tiene a secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 o 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 o 24, en el que una o más de las CDR tiene una, dos o tres mutaciones

Anticuerpos monoclonales frente a EPHA2 y procedimientos de uso de los mismos

1. Campo de la invención

La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 60/379.322; presentada el 10 de mayo de 2002, la solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 60/418.213 presentada el 14 de octubre de 2002 y la solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 60/460.507 presentada el 3 de abril de 2003.

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones diseñadas para el tratamiento, gestión o prevención de enfermedades de hiperproliferación celular, particularmente cáncer. Los procedimientos de la invención comprenden la administración de una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos específicos de EphA2, preferentemente anticuerpos monoclonales, que son agonistas de EphA2, inhiben un fenotipo celular de cáncer (tal como formación de colonias en agar blando o formación de red tubular en una preparación tridimensional de membrana basal o matriz extracelular, tal como MATRIGEL™) , preferentemente se unen a epítopos sobre EphA2 que están expuestos de forma selectiva o incrementados en las células de cáncer con respecto a las células no cancerosas y/o se unen a EphA2 con una Koff inferior a 3 x 10-3 s-1. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos monoclonales de la invención, bien solos o en combinación con uno o más de otros agentes útiles para la terapia del cáncer. También se proporcionan procedimientos diagnósticos y procedimientos para la detección selectiva de anticuerpos específicos de EphA2 terapéuticamente útiles.

2. Antecedentes de la invención

Cáncer Una neoplasia, o tumor, es una masa neoplásica resultante del crecimiento celular incontrolado anormal que puede ser benigna o maligna. En general, los tumores benignos permanecen localizados. Los tumores malignos se denominan, en conjunto, cánceres. El término “maligno” significa, en general, que el tumor puede invadir y destruir las estructuras corporales vecinas y extenderse a sitios distantes para producir la muerte (para una revisión, véase Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pág. 68-122) . El cáncer se puede producir en muchos sitios del cuerpo y comportarse de forma diferente dependiendo de su origen. Las células cancerosas destruyen la parte del cuerpo en el que se originan y, después, se diseminan a otra (s) parte (s) del cuerpo en la (s) que inician un nuevo crecimiento y causan más destrucción.

Más de 1, 2 millones de americanos desarrollan cáncer cada año. El cáncer es la segunda causa principal de muerte en EE.UU. y, si las tendencias actuales continúan, cabe esperar que el cáncer sea la causa principal de muerte para el año 2010. El cáncer de pulmón y de próstata son los cánceres más asesinos en varones en EE.UU. El cáncer de pulmón y de mama son los cánceres más asesinos en mujeres en EE.UU. A uno de cada dos varones en EE.UU. se diagnosticará cáncer en algún momento de su vida. A una de cada tres mujeres en EE.UU. se diagnosticará cáncer en algún momento de su vida.

Todavía no se ha encontrado una cura para el cáncer. Las opciones terapéuticas actuales, como cirugía, quimioterapia y radioterapia, son, a menudo, ineficaces o producen efectos secundarios graves.

Metástasis

Las formas más letales de cáncer suelen aparecer cuando una población de células tumorales obtiene la capacidad de colonizar sitios distantes y extraños en el cuerpo. Estas células metastásicas sobreviven superando las restricciones que normalmente restringen la colonización celular en tejidos distintos. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias típicas generalmente no crecerán ni sobrevivirán si se transplantan en el pulmón, aunque las metástasis pulmonares son una causa principal de morbididad y mortalidad por cáncer de mama. Pruebas recientes sugieren que la diseminación de células metastásicas por el cuerpo se puede producir mucho antes de la presentación clínica del tumor primario. Estas células micrometastásicas pueden permanecer latentes durante muchos meses o años tras la detección y eliminación del tumor primario. Por tanto, una comprensión mejor de los mecanismos que permiten el crecimiento y la supervivencia de las células metastásicas en un microambiente extraño es crucial para la mejora de los agentes terapéuticos diseñados para luchar contra el cáncer metastásico y el diagnóstico para la detección precoz y localización de metástasis,

Señalización de la célula cancerosa

El cáncer es una enfermedad de transducción aberrante de la señal. La señalización celular aberrante supera las restricciones dependientes del anclaje sobre el crecimiento y la supervivencia celular (Rhim, y col.., Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997; Patarca, Critical Reviews in Oncogenesis 7:343, 1996; Malik, y col., Biochimica et

Biophysica Acta 1287:73, 1996; Cance, y col., Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995) . La actividad de la tirosina quinasa es inducida por el anclaje de ECM y, de hecho, la expresión o la función de las tirosina quinasas normalmente están aumentada en las células malignas (Rhim, y col., Critical Reviews in Oncogenesis 8: 305, 1997; Cance, y col., Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995; Hunter, Cell 88:333, 1997) . En base a las pruebas de que la actividad de la tirosina quinasa es necesaria para el crecimiento de las células malignas, se ha apuntado a las tirosinas quinasas con nuevos agentes terapéuticos (Levitzki, y col., Science 267:1782, 1995; Kondapaka, y col., Molecular & Cellular Endocrinology 117:53, 1996; Fr y , y col., Current Opinion in BioTechnology 6: 662, 1995) . Por desgracia, los obstáculos asociados con usar específicamente las células tumorales como dianas a menudo limitan la aplicación de estos fármacos. En particular, la actividad de tirosina quinasa a menudo es vital para la función y supervivencia de los tejidos benignos (Levitzki, y col., Science 267:1782, 1995) . Para minimizar la toxicidad colateral, es crucial identificar y, después, apuntar a las tirosina quinasas que se sobreexpresan de forma selectiva en las células tumorales.

EphA2

EphA2 es una tirosina quinasa receptora de 130 kDa que se expresa en epitelios de adultos, en los que se encuentra a niveles bajos y está enriquecida en el interior de sirios de adhesión célula-célula (Zantek, y col., Cell Growth & Differentiation 10:629, 1999; Lindberg, y col., Molecular & Cellular Biology 10: 6316, 1990) . Esta localización subcelular es importante porque EphA2 se une a los ligandos (conocidos como efrinas A1 a A5) que están anclados a la membrana celular (Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403; Gale, y col., 1997, Cell & Tissue Research

290: 227) . La principal consecuencia de la unión del ligando es la autofosforilación de EphA2 (Lindberg, y col., 1990, ant.) . No obstante, al contrario que otras tirosina quinasas receptoras, EphA2 conserva la actividad enzimática en ausencia de la unión del ligando o contenido en fosfotirosina (Zantek, y col., 1999, supra) . Eph2 está regulada por aumento en un gran número de células de carcinoma agresivo.

Terapia para el cáncer Una barrera para el desarrollo de agentes anti-metástasis ha sido los sistemas de ensayo que se usan para diseñar y evaluar estos fármacos. Las terapias de cáncer más convencionales están dirigidas a las células en crecimiento rápido. No obstante, las células cancerosas no necesariamente crecen más rápido sino que sobreviven y crecen en condiciones que son no permisivas para las células normales (Lawrence y Steeg, 1996, World J. Urol. 14:124-130) . Estas diferencias fundamentales entre los comportamientos de las células normales y malignas proporcionan oportunidades para el uso de terapias dirigidas. El paradigma de que los tumores micrometastásicos ya se han diseminado por el cuerpo subraya la necesidad de evaluar los posibles fármacos quimioterapéuticos en el contexto de un microentorno extraño y tridimensional. Muchos ensayos con fármacos convencionales para el cáncer miden el crecimiento de las células tumorales o la supervivencia en condiciones normales de cultivo celular (es decir, crecimiento en monocapa) . No obstante, el comportamiento de las células en ensayos bidimensionales a menudo no predice de un modo fiable el comportamiento de las células tumorales in vivo.

Actualmente, la terapia para el cáncer puede implicar cirugía,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a EphA2 con una Koff inferior a 3 x 10-3 s-1 e induce fosforilación de la EphA2, en el que:

a. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-102.147 producido por el hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y número de registro asignado PTA-4572;

b. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-208.261 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4573;

c. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-210.248 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4574;

d. el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-233.152 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-5194;

e. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA4572;

f. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA4573;

g. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA4574;

h. el anticuerpo es producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA5194;

i. el anticuerpo comprende una cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 o 21 y una cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 o 17;

j. el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3 o 19, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o 20, una CDR de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 o 22, una CDR2 de VH que tiene a secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 o 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 o 24; o

k. el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3 o 19, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o 20, una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 o 22, una CDR2 de VH que tiene a secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 o 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 o 24, en el que una o más de las CDR tiene una, dos o tres mutaciones.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la Koff es inferior a 1 x 10-3 s-1.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es producido por un hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4572.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es producido por un hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4573.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es producido por un hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4574.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es producido por un hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-5194.

7. El anticuerpo la reivindicación 1, en el que el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-102.147 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-457Z;

8. El anticuerpo la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-208.261 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4573;

9. El anticuerpo la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-210.248 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-4574.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo compite por la unión de EphA2 con el anticuerpo Eph099B-233.152 producido por el hibridoma depositado en la ATCC y número de registro asignado PTA-5194.

11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 o 21.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 o 17.

13. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 y una cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 21 y una cadena VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17.

15. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3 y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4.

16. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8.

17. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 19 y una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 20.

18. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 22, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 24.

19. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4, una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6, una CDR2 de VH que tiene secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8.

20. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 18, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 9, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 20, una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 22, una CDR2 de VH que tiene secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 23 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 24.

21. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 7 a 20, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un fragmento Fab, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento F (ab') o una Fv unida por disulfuro.

22. El anticuerpo de la reivindicación 1 o de 7 a 20, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

23. Un anticuerpo conjugado, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes conjugado o condensado a un agente heterólogo.

24. El anticuerpo conjugado de la reivindicación 23, en el que el agente heterólogo es un agente diagnóstico o detectable.

25. El anticuerpo conjugado de la reivindicación 23, en el que el agente heterólogo es una citotoxina.

26. El anticuerpo conjugado de la reivindicación 23, en el que el agente heterólogo es un agente terapéutico o resto farmacológico.

27. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 6, 13, 14, 19, o 20.

28. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 27.

29. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 28.

30. Una célula huésped sometida a ingeniería para contener o expresar el ácido nucleico de la reivindicación 27.

31. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 31 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

33. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo conjugado de la reivindicación 23, 24, 25 o 26.

34. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 33 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

35. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

36. Uso de del anticuerpo conjugado de la reivindicación 23, 25 o 26 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

37. Uso de la reivindicación 35 o 36, en el que la composición comprende además un terapia adicional.

38. Un procedimiento in vitro para el diagnóstico de cáncer en un paciente, que comprende:

a. poner en contacto células de dicho paciente con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en las condiciones adecuadas para la unión de anticuerpo-EphA2; y

b. medir la unión del anticuerpo frente a EphA2 a dichas células, en la que un nivel de unión del anticuerpo frente a EphA2 superior al control indica que el paciente tiene cáncer.

39. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en la preparación de una composición para diagnosticar, pronosticar o monitorizar la eficacia de la terapia para el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

40. Uso del anticuerpo conjugado de la reivindicación 24 en la preparación de una composición para diagnosticar, pronosticar o monitorizar la eficacia de la terapia para el cáncer en un paciente, en el que el cáncer está asociado con la sobreexpresión de EphA2.

41. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, 39 o 40, en el que el cáncer es de origen celular epitelial.

42. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, 39 o 40, en el cáncer es un cáncer metastásico.

43. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, o 39 a 43, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de páncreas o un carcinoma de células renales.

44. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de páncreas o un carcinoma de células renales.

45. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el cáncer es de un origen celular epitelial.

46. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el cáncer es un cáncer metastásico.

47. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que las células son de sangre entera, esputo, orina, suero, o aspirados con aguja fina de tejido de células tumorales.

48. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, 39 o 40, en el que el paciente es un ser humano.

49. Uso de a reivindicación 48, en el que el ser humano es refractario a una primera terapia.

50. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el paciente es un ser humano.

51. Un hibridoma depositado en la ATCC que tiene el número de registro PTA-4572.

52. Un hibridoma depositado en la ATCC que tiene el número de registro PTA-4573.

53. Un hibridoma depositado en la ATCC que tiene el número de registro PTA-4574.

54. Un hibridoma depositado en la ATCC que tiene el número de registro PTA-5194.