CÉLULAS CON DEPRESIÓN O DELECIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEÍNA QUE PARTICIPA EN EL TRANSPORTE DE GDP-FUCOSA.

Una célula en la cual la actividad de un transportador de GDP-fucosa está suprimida o más disminuida que en su célula parental,

donde la célula se selecciona entre los siguientes (i) a (ix): (i) una célula CHO derivada de un tejido de ovario de hámster Chino; (ii) una célula de la línea celular de mieloma de rata YB2/3HL.P

Campo Técnico

La presente invención se refiere a una célula en la cual la actividad de una proteína relacionada con el transporte de GDP-fucosa al aparato de Golgi está más reducida o suprimida que en su célula parental; a un procedimiento para la produccion de una composición de anticuerpo utilizando la célula; a un procedimiento para la produccion de una composición de anticuerpo a partir del animal o planta; y a un medicamento que comprende la composición de anticuerpo.

Técnica Anterior

En la región Fc de un anticuerpo de tipo IgG, se encuentran presentes dos sitios de unión de cadenas de azúcar unidas a N-glicósido. En la IgG del suero, al sitio de unión de la cadena de azúcar, generalmente, se une una cadena de azúcar de tipo complejo que tiene numerosas ramificaciones y en la cual la adición de ácido siálico o Nacetilglucosamina bisecante es baja. Se sabe que existe una variedad con respecto a la adición de galactosa al extremo no reductor de la cadena de azúcar de tipo complejo y la adición de fucosa a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor [Biochemistry, 36, 130 (1997)].

Se ha planteado que dicha estructura de una cadena de azúcar está determinada por una glicosiltransferasa que sintetiza una cadena de azúcar y una enzima glicolítica que hidroliza la cadena de azúcar. La síntesis de una cadena de azúcar unida a N-glicósido se describe más abajo. Las glicoproteínas están modificadas con una cadena de azúcar en el lúmen del retículo endoplásmico (referido en adelante como "RE"). Durante la etapa de biosíntesis de la cadena de azúcar unida a N-glicósido, se transfiere una cadena de azúcar relativamente grande a la cadena del polipéptido que se está alargando en el lúmen del RE. En la transformación, primero se añade la cadena de azúcar seguido de los grupos fosfato de un portador lipídico de cadena larga que comprende aproximadamente 20 unidades de α-isopreno, lo que se denomina fosfato de dolicol (en adelante referido a veces como "P-Dol"). Esto es, la N-acetilglucosamina es transferida al fosfato de dolicol para formar de ese modo GlcNAc-P-P-Dol y después se transfiere un GlcNAc más para formar GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol. A continuación, se transfieren cinco manosas (referidas en adelante también como "Man") para formar de ese modo (Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol y después se transfieren cuatro Man y tres glucosas (también referidas en adelante como "Glc"). De este modo, se forma un precursor de la cadena de azúcar, (Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-Dol, denominado oligosacárido núcleo. El precursor de la cadena de azúcar que comprende 14 azúcares se transfiere en masa a un polipéptido que tiene una secuencia asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina en el lúmen del RE. En la reacción, el pirofosfato de dolicol (P-P-Dol) unido al oligosacárido núcleo se libera pero de nuevo se convierte en fosfato de dolicol por medio de hidrólisis con pirofosfatasa y se recicla. El recorte de la cadena de azúcar se inicia inmediatamente después de que la cadena de azúcar se una al polipéptido. Esto es, se eliminan 3 Glc y 1º2Man del RE, y se sabe que la α-1,2-glucosidasa I, la α-1,3-glucosidasa II y la α-1,2-manosidasa están relacionadas con la eliminación.

Las glicoproteínas que se habían sometido a recorte en el RE se transfieren al aparato de Golgi y se modifican de diferentes maneras. En la porción cis del aparato de Golgi, se encuentran presentes la N-acetilglucosamina fosfotransferasa que está relacionada con la adición de manosa fosfato, la N-acetilglucosamina 1-fosfodiester α-Nacetilglucosaminidasa y la α-manosidasa I y reducen los residuos de Man a 5. En la porción media del aparato de Golgi, se encuentran presentes la N-acetilglucosamina transferasa I (GnTI) que está relacionada con la adición de la primera GlcNAc fuera de la cadena de azúcar unida a N-glicósido de tipo complejo, la α-manosidasa II que se relaciona con la eliminación de 2 Man, la N-acetilglucosamina transferasa II (GnTII) que se relaciona con la adición de la segunda GlcNAc del exterior y la α-1,6-fucosiltransferasa que se relaciona con la adición de fucosa a la Nacetilglucosamina del extremo reductor. En la porción trans del aparato de Golgi, se encuentran presentes la galactosa transferasa que se relaciona con la adición de galactosa y la sialiltransferasa que se relaciona con la adición de ácido siálico tal como ácido N-acetilneuramínico. Se sabe que la cadena de azúcar unida a N-glicósido está formada por las actividades de estas diferentes enzimas.

Con respecto a la cadena de azúcar de un anticuerpo, Boyd et al. han examinado los efectos de una cadena de azúcar sobre la actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (referida en adelante como "actividad CCDA") y la actividad citotóxica dependiente del complemento (en adelante referida como actividad "CDC") tratando un anticuerpo injertado con CDR humana CAMPATH-1H (subclase de IgG1 humana) producido por células de ovario de hámster Chino (células CHO) o un mieloma de ratón producido por células NS0 con diferentes enzimas hidrolizantes de azúcares, y han informado de que la eliminación del ácido siálico del extremo no reductor no influía en ninguna de las actividades, pero solamente la actividad CDC resultaba afectada por la eliminación adicional de residuos de galactosa y aproximadamente el 50% de la actividad disminuía, y que la eliminación completa de la cadena de azúcar ocasionaba la desaparición de ambas actividades [Molecular Immunol., 32, 1311 (1995)]. Del mismo modo, Lifely et al. han analizado la cadena de azúcar unida a un anticuerpo injertado con CDR humana CAMPATH-1H (subclase de IgG1 humana) que había sido producido por células CHO, células NS0 o células YO de mieloma de rata, han medido su actividad CCDA, y han informado de que el CAMPATH-1H producido por células YO mostraba la actividad CCDA más alta, sugiriendo que la N-acetilglucosamina (referida en adelante a veces como "GlcNAc") en la posición bisecante es importante para la actividad [Glycobiology, 5, 813 (1995); documento WO 99/54342].

Además, con respecto a una cadena de azúcar de un anticuerpo, se ha informado de que la modificación por adición de fucosa a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar unida a N-glicósido de un anticuerpo cambia enormemente la actividad CCDA del anticuerpo (documento WO00/61739). Estos informes indican que la estructura de la cadena de azúcar juega un papel importante en las funciones efectoras de los anticuerpos humanos de la subclase IgG1.

En general, la mayor parte de los anticuerpos humanizados cuya aplicación a medicamentos se está teniendo en cuenta se preparan utilizando técnicas de recombinación genética y se producen utilizando células CHO derivadas de tejido de ovario de hámster Chino como célula anfitriona. Sin embargo, como se ha descrito antes, puesto que la estructura de la cadena de azúcar juega un papel muy importante en la función efectora de los anticuerpos y las diferencias de la estructura de la cadena de azúcar de las glicoproteínas dependen de las células anfitrionas que producen las glicoproteínas, se desea el desarrollo de una célula anfitriona que se pueda utilizar para la producción de un anticuerpo que tenga una función efectora superior.

Con el fin de ajustar la actividad de una enzima referente a la modificación de una cadena de azúcar en una célula anfitriona y modificar la estructura de la cadena de azúcar de la glicoproteína producida, se ha intentado un método en el que se aplica un inhibidor de una enzima relacionada con la modificación de la cadena de azúcar.

Los ejemplos del inhibidor de la enzima relacionada con la modificación de la cadena de azúcar incluyen la tunicamicina que inhibe selectivamente la formación de GlcNAc-P-P-Dol que es la primera etapa de la formación de un oligosacárido núcleo que es precursor de una cadena de azúcar unida a N-glicósido, la castanospermina y la Nmetil-1-desoxinojirimicina que son inhibidores de la glicosidasa I, el bromocondulitol que es un inhibidor de la glicosidasa II, la 1-desoxinojirimicina y el 1,4-dioxi-1,4-imino-D-manitol que son inhibidores de la manosidasa I, la swainsonina que es un inhibidor de la manosidasa II y similares. Los ejemplos del inhibidor específico de la glicosiltransferasa incluyen derivados desoxi de sustratos contra la N-acetilglucosamina transferasa V (GnTV) y similares [Glycobiology Series 2 -Destiny of Sugar Chain in Cell (Kodan-sha Scientific), editada por Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori y Akira Kobata (1993)]. Asimismo, se sabe que la 1-desoxinojirimicina inhibe la síntesis de una cadena de azúcar... [Seguir leyendo]

1. Una célula en la cual la actividad de un transportador de GDP-fucosa está suprimida o más disminuida que en su célula parental, donde la célula se selecciona entre los siguientes (i) a (ix):

(i) una célula CHO derivada de un tejido de ovario de hámster Chino;

(ii) una célula de la línea celular de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20;

(iii) una célula de la línea celular de mieloma de ratón NS0;

(iv) una célula de la línea celular de mieloma de ratón SP2/0-Ag14;

(v) una célula BHK derivada de un tejido de riñón de hámster Sirio;

(vi) una célula de hibridoma que produce un anticuerpo;

(vii) una célula de la línea celular leucémica humana Namalwa;

(viii) una célula pluripotencial embrionaria no humana;

(ix) una célula huevo fertilizada no humana,

donde el transportador de GDP-fucosa es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a

(c) o una proteína codificada por un ADN seleccionado entre (d) y (e):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b) una proteína que comprende un secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos son suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad transportadora de GDP-fucosa;

(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad transportadora de GDP-fucosa;

(d) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1;

(e) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 en condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene una actividad transportadora de GDP-fucosa,

donde la actividad de dicho transportador de GDP-fucosa está disminuida o suprimida por medio de una técnica de ingeniería genética, donde la técnica de ingeniería genética se selecciona del grupo que consiste en (1) a (3):

(1) una técnica de desorganización génica que comprende dirigir un gen que codifica dicho transportador de GDP-fucosa;

(2) una técnica para introducir un mutante negativo dominante de dicho transportador de GDP-fucosa, donde el mutante negativo dominante de dicho transportador de GDP-fucosa es un mutante por deleción N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa;

(3) una técnica para suprimir la transcripción y/o traducción de dicho transportador de GDP-fucosa.

2. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mutante por deleción N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa es un mutante por deleción N-terminal en el que se suprimen 30 aminoácidos en el extremo N de dicho transportador de GDP-fucosa.

3. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, donde la técnica para suprimir la transcripción y/o traducción de dicho transportador de GDP-fucosa es un método de ARNi (ARN de interferencia).

4. La célula de acuerdo con la reivindicación 3, donde el método de ARNi es la utilización de un ARN de doble hebra que comprende un ARN y su ARN complementario, cuyo ARN de doble hebra es introducido o expresado en la célula, siendo capaz dicho ARN comprendido en el ARN de doble hebra de disminuir la cantidad de ARNm de dicho transportador de GDP-fucosa, donde dicho ARN de doble hebra es un ARN correspondiente a un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de 10 a 30 nucleótidos continuos en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

5. La célula de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, donde el método de ARNi es la utilización de un ARN de doble hebra que comprende un ARN seleccionado del grupo que consiste en (a) y (b) y su ARN complementario, cuyo ARN de doble hebra es introducido o expresado en la célula para disminuir de ese modo la cantidad de ARNm de dicho transportador de GDP-fucosa:

(a) un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33;

(b) un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos en la que uno o unos pocos nucleótidos son suprimidos o añadidos a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33 y tiene esencialmente la misma actividad de ARNi que la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33.

6. La célula de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, donde el ARN de doble hebra es introducido en la célula utilizando un vector en el que se introducen un ADN correspondiente al ARN de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 y su ADN complementario.

7. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena de azúcar conectada a un Nglicósido complejo.

8. La célula de acuerdo con la reivindicación 7, que es resistente a al menos una lectina seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):

(a) una lectina de Lens culinaris;

(b) una lectina de Pisum sativum;

(c) una lectina de Vicia faba;

(d) una lectina de Aleuria aurantia.

9. Una célula en la que un gen que codifica una molécula de anticuerpo es introducido en la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. La célula de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):

(a) un anticuerpo humano;

(b) un anticuerpo humanizado;

(c) un fragmento de anticuerpo que comprende la región Fc de (a) o (b);

(d) una proteína de fusión que comprende la región Fc de (a) o (b).

11. La célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.

12. Un procedimiento para la produccion de una composición de anticuerpo, que comprende utilizar la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde la composición de anticuerpo tiene una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos superior y tiene una proporción superior de cadena de azúcar en la cual la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre las cadenas de azúcar conectadas a N-glicósido complejo totales unidas a la región Fc en la composición de anticuerpo que una composición de anticuerpo producida por la célula parental.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende cultivar la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en un medio para formar y acumular una composición de anticuerpo en el cultivo; y recuperar la composición de anticuerpo del cultivo.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, donde la proporción de una cadena de azúcar en la cual la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α es del 20% o más de las cadenas de azúcar conectadas a N-glicósido complejo totales unidas a la región Fc de la composición de anticuerpo.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, donde la cadena de azúcar en la cual la fucosa no está unida es una cadena de azúcar en la cual la posición 1 de la fucosa no está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar conectada a un N-glicósido complejo a través de un enlace α.

16. Una composición de anticuerpo producida mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

17. Un medicamento que comprende como ingrediente activo la composición de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16.

18. Un anticuerpo producido mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para la diagnosis, prevención o tratamiento de enfermedades acompañadas de tumores, enfermedades acompañadas de alergia, enfermedades acompañadas de inflamación, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades acompañadas de infecciones virales o enfermedades acompañadas de infecciones bacterianas.

19. Una proteína que inhibe la función de un transportador de GDP-fucosa, donde el transportador de GDP-fucosa es una proteína seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos son suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad transportadora de GDP-fucosa; y

(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad transportadora de GDP-fucosa,

donde la proteína que inhibe la función de dicho transportador de GDP-fucosa es una proteína negativa dominante de dicho transportador de GDP-fucosa, y donde la proteína negativa dominante de dicho transportador de GDPfucosa es un mutante por deleción N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa.

20. La proteína de acuerdo con la reivindicación 19, donde el mutante por deleción N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa es un mutante por deleción N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa en el que se suprimen 30 aminoácidos del extremo N-terminal de dicho transportador de GDP-fucosa.

21. Un ADN que codifica la proteína de acuerdo con la reivindicación 19 o 20.

22. Un ARN de doble hebra que comprende un ARN seleccionado del grupo que consiste en

(a) un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33;

(b) un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos en la que uno o unos pocos nucleótidos son suprimidos o añadidos a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33 y tiene esencialmente la misma actividad de ARNi que la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 33 para un transportador de GDP-fucosa como se define en la reivindicación 1.

23. Un ADN correspondiente al ARN de acuerdo con la reivindicación 22 y su ADN complementario.

24. El ADN de acuerdo con la reivindicación 23, donde el ADN correspondiente al ARN está representado por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 16.

25. Un ADN recombinante que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 23 o 24 y su ADN complementario.

26. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 25, que se constituye para expresar el ARN de doble hebra de acuerdo con la reivindicación 22.

27. Un transformante, que es una célula que tiene introducido el ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 25 o26.

28. Un procedimiento para la produccion de una célula resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena de azúcar conectada a un N-glicosido complejo, que comprende introducir y/o expresar en una célula el ARN de doble hebra de acuerdo con la reivindicación 22.

29. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha introducción del ARN de doble hebra es la introducción de un vector en el que se inserta un ADN complementario al ARN de acuerdo con la reivindicación 25 o

26.

30. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28 o 29, donde la célula resistente a lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena de azúcar conectada a un N-glicósido complejo es una célula resistente a al menos una lectina seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):

(a) una lectina de Lens culinaris;

(b) una lectina de Pisum sativum;

(c) una lectina de Vicia faba;

(d) una lectina de Aleuria aurantia.

31. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una levadura, una célula animal, y una célula de insecto.

32. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, donde la célula se selecciona 5 del grupo que consiste en los siguientes (a) a (i):

(a) una célula CHO derivada de un tejido de ovario de hámster Chino;

(b) una célula de la línea celular de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20;

(h) una célula pluripotencial embrionaria no humana; 15 (i) una célula huevo fertilizada no humana.